«Федеральное государственное автономное образовательное учреждениевысшего профессионального образования«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ...»

Федеральное государственное автономное

образовательное учреждениевысшего профессионального образования«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Институт фундаментальной биологии и биотехнологии

Кафедра биофизики

РЕФЕРАТ

по Информационно-коммуникационным технологиям в естественнонаучных исследованиях

Современные направления исследований в области получения и практического применения аптамеров

Преподаватель __________ И. Е. Суковатая

подпись, дата

Студент БФ12-02М 041204091 _________ О.А.Зубкова

подпись, дата

Красноярск 2012

Оглавление

TOC \o "1-3" \h \z \u 1 Обзор литературы PAGEREF _Toc341561846 \h 11.1 Характеристика аптамеров PAGEREF _Toc341561847 \h 11.2 Технология cell-SELEX PAGEREF _Toc341561848 \h 21.3 Аптамеры в терапии онкологических заболеваний PAGEREF _Toc341561849 \h 31.3.1 Селекция аптамеров к глиобластоме PAGEREF _Toc341561850 \h 4Список использованных источников: PAGEREF _Toc341561851 \h 5

1 Обзор литературы1.1 Характеристика аптамеровАптамеры – одноцепочечные последовательности РНК или ДНК, связывающиеся с молекулярными мишенями с высокой аффинностью и специфичностью. Аптамеры получают с помощью селекции in vitro, известной как SELEX (от англ. «systematic evolution of ligands by exponential enrichment» - «систематическая эволюция лигандов при экспоненциальном обогащении»), впервые описанной двумя независимыми лабораториями в 1990 году.

Способность аптамеров избирательно связываться с мишенями основана на уникальной третичной структуре, позволяющей им формировать стабильные специфичные комплексы с различными мишенями комплементарной формы. Аффинность аптамеров к мишеням очень высока, как правило, константа диссоциации находится в диапазоне от пМ до нМ [;]. Свойства аптамеров, а именно высокая аффинность и специфичность, присущи и антителам, но аптамеры обладают преимуществами по сравнению с антителами. Аптамеры получают путем химического синтеза, что позволяет исследователям быстро синтезировать последовательности ДНК или РНК. Как синтетические молекулы они сохраняют сайт-специфичную модификацию, а также могут быть с легкостью помечены флуоресцентной меткой, биотином или радионуклидом. Для реализации терапевтических задач к аптамерам можно присоединять наночастицы, лекарственные молекулы или вирусы. В отличие от антител аптамеры остаются стабильными в широком диапазоне температур и условий хранения. Даже термически-денатурированные аптамеры могут восстановить свою первоначальную конформацию без потери аффинности после одного цикла «нагрев-охлаждение», в то время как антитела чувствительны к изменению температуры, и, как правило, денатурация их необратима. Кроме того, небольшой размер обеспечивает быстрое проникновение в органы и ткани, а низкая токсичность и иммуногенность – долгосрочный терапевтический эффект и безопасность. Эти уникальные биохимические свойства позволяют аптамерам стать эффективными средствами для диагностики и лечения различных заболеваний [1;2].

Так, на основе аптамеров к рецептору эпидермального фактора роста создан биочип для обнаружения циркулирующих раковых клеток в периферической крови человека [].

1.2 Технология cell-SELEXТрадиционно аптамеры подбираются к очищенному рекомбинантному белку. Преимуществом использования очищенного белка в качестве мишени является легкость достижения специфичности во время селекции. Однако если структура очищенного белка не соответствует таковой в нативном состоянии, то полученные таким образом аптамеры не узнают белок в его естественной конформации.

Для решения этой проблемы, была разработана технология селекции аптамеров к целым живым клеткам, названная cell-SELEX. При этом для cell-SELEX не требуется никакой предварительной информации о структуре белка, нет необходимости его очистки. Все молекулы на клеточной поверхности остаются в естественном окружении, сохраняя нативную структуру, обусловленную посттрансляционными модификациями, на протяжении всего процесса селекции. Таким образом, аптамеры, подобранные к целой клетке, способны связываться с мишенью, находящейся в нативной конформации непосредственно на клеточной поверхности [1]. Методом cell-SELEX были созданы аптамеры к бактериям Trypanosoma cruzi [], Salmonella enteritidis [].

T. cruzi – опасный паразит человека, возбудитель болезни Шагаса. Бактерию можно обнаружить в крови, однако в хронической фазе заболевания количество паразитов снижается, и их обнаружение становится весьма проблематично. Аптамеры, подобранные к T. cruzi, характеризуются высоким сродством к мишени (Кд 8–25 нM) и эффективны при низкой концентрации бактерий (5 паразитов на 15 мл цельной крови) [4].

Результатом другого исследования стало создание аптасенсора, чувствительного к бактериям S. enteritidis. Аптасенсор может обнаружить бактерии, даже если их концентрация в пробе составляет 600 КОЕ/мл-1 или 18 КОЕ в 30 мкл пробы. Помимо этого он в состоянии отличить S. enteritidis от других бактерий рода Salmonella, а также от Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter f reundii, поскольку все эти бактерии были выбраны в качестве мишеней для негативной селекции на этапе отбора аптамеров [5].

1.3 Аптамеры в терапии онкологических заболеванийАптамеры, полученные методом cell-SELEX, способны специфично связываться с белками на клеточной поверхности, являющимися маркерами различных заболеваний. Они могут выступать как терапевтические агенты благодаря ингибирующему действию на белки – мишени, функции которых нарушены при онкологических заболеваниях. В качестве примера можно привести рецептор тирозинкиназы RET, мутации которого вызывают множественную эндокринную неоплазию (МЭН) II А и II В типов. С помощью технологии cell-SELEX были выбраны аптамеры к мутировавшей форме RET. Для позитивной селекции были выбраны клетки линии РС12 – производные феохромоцитомы, в избытке экспрессирующие мутантный внеклеточный домен рецептора RET, для негативной селекции – клетки PC12 и клетки РС12 с гиперэкспрессией того же домена, но дикого типа. После 15 раундов селекции были получены аптамеры не просто специфичные к мутантной форме RET, но и ингибирующие активность RET-опосредованного сигнального пути, что позволяет говорить о значительном потенциале данных аптамеров для терапии МЭН. Последними достижениями в этой области является создание противоопухолевых аптамеров к рецепторам тенасцин-С и TGF- III типа.

Еще один пример успешного использования аптамеров в борьбе с раком – работа, в ходе которой были объединены два аптамера, связывающиеся с опухолевой клеткой и NK-клеткой (nature killer cell). Один из аптамеров подобран к CD16, экспрессирующемуся NK-клетками, которрые играют ключевую роль в явлении антитело-зависимой цитотоксичности. Другой аптамер специфичен к рецептору фактора роста гепатоцитов (с-Met), в избытке экспрессирующемуся клетками многих типов рака. Аптамеры связываются олигонуклеотидным линкером в систему, которая может осуществлять цитотоксичную функцию и уничтожать опухолевые клетки [1].

1.3.1 Селекция аптамеров к клеткам глиобластомыГлиобластома – злокачественная опухоль головного мозга. Хотя частота заболеваемости этим типом рака невысока (1,35% от всех первичных раковых заболеваний в США), средняя продолжительность жизни после диагностирования составляет 12 месяцев, что делает глиобластому одним из самых агрессивных типов рака.

Селекция аптамеров проводилась с помощью технологии cell-SELEX, при этом отсутствовал этап негативной селекции. Несмотря на это специфичность выбранных аптамеров оказалась достаточно высока. Они оказались способны связываться не только с клетками глиобластомы линии A-172, к которым и проводилась селекция, но также к другим клеточным линиям этого типа опухоли. При этом степень связываемости с клетками других опухолей (легкого, эпителия, яичников и др) была низкой или связывания не наблюдалось вовсе.

При воздействии на клетки протеинкиназой К, связываемость аптамеров значительно снижалась, это позволяет утверждать с большой долей вероятности, что мишенями аптамеров являются белки на поверхности клетки или молекулы, ассоциированные с белками []. В другой работе [] описывается методика доставки лекарственных препаратов к месту локализации глиомы. Наночастицы из полиэтиленгликоль-поли--капролактона были покрыты аптамером GMT8 (специфичен к клеткам глиобластомы человека линии U87) с флуоресцентной меткой. В качестве модели лекарственного препарата для целевой доставки использовали доцетаксел - цитостатический препарат растительного происхождения из группы таксанов. Данная система (ApNP) продемонстрировала положительные результаты в экспериментах in vitro и in vivo (на мышиной модели): была показана способность частиц проникать внутрь опухолевого сфероида и индуцировать апоптоз клеток, а также достигать непосредственно участков головного, пораженных опухолью и ингибировать ее рост.

Таким образом, судя по последним литературным данным, аптамеры привлекают все большее внимание исследователей во всем мире. Перспективы их использования связаны с диагностикой и терапией различных заболеваний, в том числе и онкологических. В последнее время активно ведутся разработки по созданию аптасенсоров, которые позволили бы детектировать те или иные мишени (бактерии, вирусы, раковые клетки и т.д.) в крови или других физиологических жидкостях. Также аптамеры могут стать средством для целевой доставки лекарственных веществ, что особенно актуально в терапии заболеваний головного мозга, так как часто молекулы лекарств не могут самостоятельно преодолеть гематоэнцефалический барьер и проникнуть в мозг. Дальнейшие разработки в области получения и применения аптамеров позволят раскрыть все их потенциальные возможности в биологии, медицине и фармакологии.

Список использованных источников: