WWW.LI.I-DOCX.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные ресурсы
 

Pages:   || 2 |

«БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ВИДОВАЯ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ НЕТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ В РЕСПУБЛИКЕ ТАДЖИКИСТАН ...»

-- [ Страница 1 ] --

ТАДЖИКСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ

Экз. №______

На правах рукописи

РАДЖАБОВ ХИКМАТУЛЛО ИСМАТОВИЧ

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ВИДОВАЯ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ НЕТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ В РЕСПУБЛИКЕ ТАДЖИКИСТАН

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксиологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук,

профессор, член-корреспондент ТАСХН

Мирзоев Д.М.

Душанбе-2015

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы…………………………………………………………...4

1.2. Цель и задача исследований…………………………………………………6

1.3. Научная новизна……………………………………………………………...7

1.4. Теоретическая и практическая значимость…………………………………7

1.5. Личный вклад…………………………………………………………………8

1.6. Апробация работы……………………………………………………………8

1.7. Основные положения, выносимые на защиту……………………………...8

1.8. Публикация результатов исследований…………………………………….9

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………9

2.1. Туберкулез (Tuberculosis) общие сведения о возбудителях туберкулеза...9

2.2. Проблема неспецифических реакций на туберкулин и атипичные микобактерии…………………………………………………………………….11

2.3. Атипичные (нетуберкулезные) микобактерии……………………………15

2.4. Классификация микобактерии……………………………………………..20

2.5. Сенсибилизирующие свойства атипичных микобактерии………………22

2.6. Лабораторные методы диагностики туберкулеза животных…………….36

2.6.1. Бактериоскопический метод……………………………………………..36

2.6.2.Культуральный метод……………………………………………………..38

2.6.3.Биологический метод……………………………………………………...43

2.7. Патоморфологический метод………………………………………………47

2.8. Молекулярно-генетические исследования ……………………………….52

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………………….57

3.1. Материалы и методы исследования……………………………………….57

4. РЕЗУЛЬТАТ ИССЛЕДОВАНИЙ……………………………………….…69

4.1.Актуальность проблемы выделения различных видов микобактерий на территории республики Таджикистан и климато-географическая характеристика Хатлонская область.……………………………………….…76

4.1.1. Климато географическая характеристика Хатлонской области РТ…..77

4.1.2. Анализ эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в Хатлонской области РТ………………………………………………...78

4.1.3. Оптимизация системы идентификации наиболее часто выделяемых видов микобактерий с применением культурально-морфологических, биохимических и бактериологических методов……………………………….82

4.1.4. Определение родовой принадлежности выделенных культур на яичных питательных средах……………………………………………………………...83

4.1.5. Дифференциация возбудителей туберкулеза и нетуберкулезных микобактерий…………………………………………………………………….84





4.1.6. Дифференциация нетуберкулезных микобактерий на группы по Раньону…………………………………………………………………………...88

4.1.7. Частота выделения микобактерий из биоматериала от реагировавщих и нереагировавщих на туберкулин животных и объектов внешней среды……89

4.1.8. Изучение сенсибилизирующих свойств выделенных культур атипичных микобактерий……………………………………………………...103

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ………………..110

6. ВЫВОДЫ……………………………………………………………………115

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ…………………………………...117

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………...…118

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы.

Среди инфекционных заболеваний животных особого внимания заслуживает туберкулез крупного рогатого скота, так как эта болезнь не только причиняет большой экономический ущерб животноводству, но и представляет серьезную опасность для здоровья людей.

Так по данным ВОЗ, в настоящее время болеют туберкулезом 48 млн. человек, ежегодно заболевают 8 млн. и ежегодно умирают от туберкулеза около 3-х млн. человек.

Поэтому, в 1982 г. учитывая сложившуюся ситуацию по туберкулезу в мире Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) и Международный союз борьбы с туберкулезом объявили туберкулез «Проблемой всемирной опасности» и «Экологическим бедствием ХХ века» а 24 марта - «Всемирным днем борьбы против туберкулеза» (24 марта 1882 года Р. Кох на Берлинском обществе физиологов доложил об открытии им возбудителя туберкулеза).Известно, что основой профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулезе животных является диагностика этой болезни. Для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и на сегодняшний день основным, массовым и общедоступным для применения в широкой ветеринарной практике методом является внутрикожная туберкулиновая проба с ППД туберкулином для млекопитающих.

В последние годы при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота внутрикожной пробой с ППД туберкулином для млекопитающих все более актуальной становится проблема неспецифических реакций на туберкулин. Так, в настоящее время, в благополучных хозяйствах выявляется больше реагирующих на туберкулин животных, чем в неблагополучных хозяйствах. Массовые выявления «неспецифических» реакций на туберкулин приводят к убою большого количества реагирующих здоровых животных, что увеличивает размеры экономического ущерба и вызывает обоснованные сомнения в правильности диагностики туберкулеза утвержденными методами. То есть, проблема неспецифических реакций на туберкулин приобретает чрезвычайную актуальность.

Неспецифические реакции на туберкулин условно разделяют на парааллергические, когда в основе возникновения их лежит сенсибилизация организма животных различными видами микобактерий и псевдоаллергические обусловленные причинами немикобактериального характера или неустановленной природы.

Парааллергические реакции на туберкулин отмечали у сенсибилизированных атипичными микобактериями животных (E. Ranyon, 1959; O. Muinser, 1960; I. Nyiredy, 1966; В.В. Судаченков, А.Н. Шаров, 1969, 1978,1989; Р.В. Тузова, А.А. Кузяев, 1971; J. Seeder, 1972; Х.Г. Гизатулин с соавт. 1972; К.К.Тяхнас, 1973; В.С. Тырина, 1973; C. Seravski, P. Sudabek 1973; J. Weisafeiler, 1975; А.В. Гуркин с соавт. 1977; А.М. Кадочкин 1979; Ю.А. Кассич, В.А. с соавт. 1985, 1990; А.И.Пахомов 1985; А.А. Ткаченко 1985; В.У. Свиридов, 1989; Н.П. Овдиенко с соавт. 1989, 1990; Р.В. Тузова, А.А. Кузяев, 1990; А.А Лазовская с соавт. 1994; Д.М. Мирзоев, 1989, 1997; А Хабибов, 2000; А.Х. Найманов, 1993, 2002; Р.А. Нуратинов, 1998; А.С. Донченко с соавт. 2000, 2004, 2011; Н.И. Прокопьева, 2003.

Основной причиной этих реакций, большинство авторов считают сенсибилизацию организма животных близкородственными микобактериями туберкулеза птичьего вида и атипичными микобактериями. Атипичные микобактерии широко распространенны в природе. Многие авторы считают, что атипичные микобактерии входят в состав нормальной почвенной микрофлоры. Кроме того установлено, что атипичные микобактерии являются частью окружающей нас внешней среды и мы не можем от них избавиться. Значит необходимо распознавать туберкулез, дифференцировать аллергические реакции на туберкулин, проводить профилактические и оздоровительные мероприятия при туберкулезе, при постоянном окружении и влиянии различных, близкородственных видов атипичных микобактерий.

В эпизоотологии туберкулеза проблема видового состава выделяемых микобактерии и его региональных особенностей имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение, так как создает основу для дифференцированного проведения профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулезе животных. Кроме того, определение видовой принадлежности выделенных на определенной территории микобактерий, персистирующих и циркулирующих в организме животных и окружающей внешней среде обитания, позволяет точно выявить ареал распространения микобактерий и источники инфицирования различных видов животных, человека и птиц.

Н.П. Овдиенко, В.И. Косенко, А.Х. НаймановА.М. Кадочкин, Б.И. Антонов, М.И Герман (1990) указывают, что атипичные микобактерии широко распространены в природе и их можно выделять из разных объектов внешней среды, фекалий и молока коров. Однако не ясны причины, при которых начинает проявляться сенсибилизация, по видимому неоднократное поступление значительного количества атипичных микобактерий и изменение физиологического состояния организма животных под влиянием неблагоприятных условий содержания способствует такой сенсибилизации и у животных происходит иммунологическая перестройка. Поэтому, целесообразно проводить изучение реактивности организма животных и носительства разных видов микобактерий на разных территориях страны.

С учетом указанного, считаем, что на современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота в республике Таджикистан, изучение распространения, видовой принадлежности и сенсибилизирующих свойств выделенных культур атипичных микобактерий является своевременной и актуальной темой для выполнения диссертационной работы.

1.2. Цель и задача исследований.

Целью исследований являлось изучение распространенности, видового состава атипичных микобактерий выделенных от реагировавших на туберкулин животных в животноводческих хозяйствах республики Таджикистан, а также определение сенсибилизирующих свойств наиболее распространенных на территории республики видов атипичных микобактерий.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выделить культуры микобактерий из проб биоматериала от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота;

- изучить культурально-морфологические свойства выделенных культур микобактерий;

- изучить биохимические свойства выделенных культур микобактерий

- изучить сенсибилизирующие свойства некоторых видов выделенных культур атипичных микобактерий.

1.3. Научная новизна.

Впервые в республике Таджикистан изучено распространенность и видовой состав атипичных микобактерий выделенных от реагировавших на туберкулин животных с неспецифическими реакциями. Изучены и охарактеризованы культурально-морфологические свойства основных видов атипичных (нетуберкулезных) микобактерий выделенных из биоматериала от реагировавших на туберкулин животных. Оптимизирована схема идентификации наиболее часто выделяемых видов микобактерий. Установлены сенсибилизирующие свойства атипичных микобактерий: M. Intracellularae, M. Fortuitum, M. Smegmаtis, M. Scrofulaceum.

1.4. Теоретическая и практическая значимость

Результаты исследований по определению распространенности и видового состава микобактерий, выделенных от реагировавших на туберкулин животных создают основу для дифференцированного проведения профилактических и оздоровительных мероприятий при микобактериальных инфекциях. Определение видового состава и сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий является основой для создания и конструирования аллергенов для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин методом симультанной туберкулиновой пробы.

Оптимизированная схема идентификации основных видов атипичных микобактерий повышает качество бактериологических исследований при микобактериозах животных и может быть использована в бактериологических лабораториях в повседневной работе с культурами микобактерий.

1.5. Личный вклад соискателя заключается в бактериологическом исследовании проб биоматериала от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота, изучении культурально-морфологических, биологических свойств микобактерий, анализе и обобщении результатов исследований, разработке оптимизированной схемы идентификации атипичных микобактерий.

1.6. Апробация работы

Материалы исследований доложены на:

- заседании Ученого Совета Ветеринарного института ТАСХН 2010-2014 гг.;

- научной конференции Ветеринарного института посвященной 20-летию ТАСХН в 2011 г.;

- научной конференции молодых ученых Ветеринарного института ТАСХН, Душанбе 2013-2014гг.

1.7. Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные результаты исследований позволяют вынести на защиту следующие положения:

- результаты установления распространенности и видового состава атипичных микобактерий выделенных от реагировавших на туберкулин животных с неспецифическими реакциями;

- результаты изучения культурально-морфологических и биохимических свойств разных видов микобактерий;

- результаты изучения сенсибилизирующих свойств некоторых видов атипичных микобактерий;

- оптимизированная схема идентификации наиболее часто выделяемых атипичных микобактерий.

1.8. Публикация результатов исследований

По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных статях, в том числе 3 в журнале, рекомендованном Вак Минобразования и науки РФ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Туберкулез (Tuberculosis) общие сведения о возбудителях туберкулеза.

Хроническое инфекционное заболевание практически всех видов животных и человека, характеризующееся образованием в различных органах специфических бугорков-туберкулов вызываемые патогенными микобактериями туберкулеза.

Возбудитель туберкулеза – занимает промежуточное положение между грибами и бактериями. Mycobacterium (mycos -гриб, bacterium -палочка). В соответствии современной классификации относится к роду Mycobacterium, семейству Mycobacteriaceae, порядку Actinomycetales. Микобактерии имеют палочковидную форму, грамположительны, обладают кислото- и спиртоустойчивостью, аэробы, неподвижны, спор и капсул не образуют.

Род микобактерий - единственный в группе микобактерий.

Перечень признаков для отнесения микроорганизмов к роду микобактерий включает: кислото- и щелочеустойчивость после окраски карболовым фуксином; высокое содержание липидов в клетке и особенно в клеточных стенках; содержание Г+Ц (гуанидин и цитазин) в ДНК колеблется от 62 до 70 мол%.

По способности синтезировать миколовые кислоты и процентному содержанию Г+Ц в ДНК микобактерии вплотную приближаются к группе нокардиоформных актиномицетов и коринобактериям, но различаются по устойчивости к лизоциму и активности арильсульфатазы.

Микобактерии растут медленно и очень медленно. Оптимальная температура роста микобактерий имеет широкий диапазон для различных видов и составляет 30-45оС.

Болезни людей и животных, вызываемые возбудителями рода Mycobacterium, называются микобактериозами. В род Mycobacterium входят боле 45 видов микобактерий.

Туберкулез у животных вызывают микобактерии туберкулеза бычьего (M. Bovis ) человеческого (M. Tuberculosis) и птичьего (M. Avium) видов. Каждый из этих видов микобактерий является патогенным для животных соответствующего вида и человека, возможно и перекрестное заражение.

M. Bovis – патогенны для крупного рогатого скота. К ним восприимчивы все млекопитающие животные и человек.

К M. Tuberculosis восприимчивы, кроме человека, свиньи, козы, кошки и собаки. M. Tuberculosis в основном сенсибилизирует крупный рогатый скот к туберкулину и только иногда может вызывать незначительные очаги в отдельных лимфатических узлах.

M. Avium – возбудитель туберкулеза птиц. Может вызывать патологические изменения у свиней. У крупного рогатого скота вызывает кратковременную сенсибилизацию организма к туберкулину.

D. Matthous (1980) приводит данные о частоте выделений микобактерий туберкулеза от различных видов животных.

п/п Животные Процент выделения микобактерий туберкулеза

M.Bovis M. Tuberculosis M.Avium

1. Крупный рогатый скот 78,4 0,5 21,1

2. Козы 97,9 0 2,1

3. Овцы 59,2 0,8 40,0

4. Лошади 86,2 6,0 7,8

5. Свиньи 40,2 6,7 53,1

6. Собаки 29,5 70 0,5

7. Кошки 95,5 4,5 0

Приведенные данные показывают, что

- от крупного рогатого скота выделяют, в основном, M. Bovis (78,4%), реже M.Avium (21,1%), и очень редко M. Tuberculosis (0,5%);

- от коз выделяют, в основном M.Bovis (97,9%), и редко M. Avium (2,1%)

- от овец - M. Bovis (59,2%), M.Avium (40,0%), и редко M. Tuberculosis (0,8%);

- от лошадей - M. Bovis (86,2%), M.Avium (7,8%), и M. Tuberculosis (6,0%);

- от свиней - M. Avium (53,1%), M.Bovis (40,2%), и M. Tuberculosis (6,7%);

- от собак - M. Tuberculosis (70,0%), M.Bovis (29,5%), и M. Avium (0,5%);

- от кошек - M. Bovis (95,5%), и M. Tuberculosis (4,5%).

По-видимому, частота выделения разных видов микобактерий туберкулеза от различных животных, прежде всего, зависит от возможного контакта и факторов передачи возбудителя.

2.2. Проблема неспецифических реакций на туберкулин и атипичные микобактерии

После открытия возбудителя туберкулеза (Р.Кох, 1882; 1890), уже в начальной стадии применения туберкулиновой пробы и аллергической диагностики туберкулеза некоторые исследователи обратили внимание на неспецифические реакции – когда у реагирующих на туберкулин животных отсутствовали характерные для туберкулеза изменения, а лабораторные исследования патматериала от убитых животных давали отрицательный результат.

А. Eber (1895) впервые столкнулся с фактом, когда не у всех реагировавших на туберкулин животных на вскрытии был подтвержден диагноз на туберкулез.

В дальнейшем этой проблемой занимались I. Marsh (1932) A. Grawford (1936), A. Meyn (1953), D. Lauterbach (1953), T. Schliseser (1953).

В 50-е годы большинство авторов причисляли к причинам неспецифических реакций возбудителей туберкулеза птичьего вида, паратуберкулеза, «узелкового дерматита» (Dermanits nodosa) М.К. Юсковец (1953), И.В. Поддубский (1953), W. Witcherlich, J. Reus (1953), C. Peterson (1956), A. Meyn (1957).

В дальнейшем в разные годы, в разных странах все больше исследователей стали получать доказательства того, что неспецифические реакции из казуистических случаев стали превращаться в острую проблему повсеместного проявления неспецифических реакций при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.

В настоящее время основой оздоровительных и профилактических мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота является диагностика болезни внутрикожной туберкулиновой пробой. Основной недостаток внутрикожной туберкулиновой пробы, в том что она указывает только на заражение животных различными видами микобактерий. В связи с тем, что животные могут быть заражены или сенсибилизированы не только микобактериями туберкулеза (M. Bovis и M. Tuberculosis), но и разного вида близкородственными нетуберкулезными (атипичными) микобактериями – внутрикожная туберкулиновая проба выявляет наряду с больными животными и здоровых животных с неспецифическими реакциями на туберкулин.

Атипичные микобактерии имеют общие с M. Bovis антигенные детерминанты, которых достаточно для сенсибилизации и аллергического ответа организма на туберкулин М.М. Авербах, 1976; Н.В. Медуницин, 1983. Такие атипичные микобактерии приживаются в организме от 1 до 3 и более месяцев (J. Ueiszfeiler, 1975; В.Д. Свиридов, 1989).

При убое реагирующих животных с неспецифическими реакциями, характерных для туберкулеза изменений не обнаруживают, биопроба на морских свинках - отрицательная, а при культуральном исследовании патматериала от убитых животных, как правило, выделяют атипичные микобактерии. В этой связи лабораторная диагностика туберкулеза приобретает первостепенное значение для оценки эпизоотического состояния хозяйств по туберкулезу.

Неспецифические реакции на туберкулин условно разделяют на парааллергические, когда в основе возникновения их лежит сенсибилизация организма животных различными видами микобактерий, и псевдоаллергические, обусловленные причинами немикобактериального характера или неустановленной природы.

Дифференциальная диагностика неспецифических реакций остается основной проблемой при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. Со времени возникновения этой проблемы были предложены различные методы их дифференциации: применение малых доз туберкулина, переисследование реагирующих животных глазной пробой, внутривенной пробой, пальпебральной пробой, реакция бласттрансформации лимфоцитов, реакция специфического лизиса лейкоцитов, надплевральная новокаиновая блокада, метод подавления неспецифических реакций раствором хлористого кальция, симультанная туберкулиновая проба с различными аллергенами, применение серологических реакций (РСК с КТА УНИИЭВ, РНГА с полисхаридным антигеном ВИЭВ и др.

Однако, наибольшее признание и распространение во всем мире получил метод симультанной пробы с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц. Этот метод известен давно. Так, еще в 1925 году K. Plum отметил повышенную реактивность скота, зараженного микобактериями туберкулез птичьего вида, на туберкулин для птиц и меньшую на туберкулин для млекопитающих.

В дальнейшем многими исследователями было подтверждено, что при исследовании «неспецифически» реагирующих животных, одновременно туберкулинами для млекопитающих и птиц, более выраженные реакции отмечают на туберкулин для птиц.

В настоящее время во всех зарубежных странах для дифференциации неспецифических реакций применяют симультанную пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц. В Российской федерации для дифференциации неспецифических реакций с 1978 года используется симультанная проба с применением ППД-туберкулина для млекопитающих и комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ). В состав КАМ раньше входили три вида атипичных микобактерий:

M. Intracellularae (3 гр. по Раньону), M. Scrofulaceum (2 гр.) M. Kansasii (1 гр.). Впоследствии, в связи с тем, что M. Kansasii на территории России не выделяется, его исключили из состава КАМ, т.е. в настоящее время КАМ готовят только из двух видов атипичных микобактерий (M. Intracellularae и M. Scrofulaceum).

Следует отметит, что в соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» от 25.02.86 г. Для дифференциации аллергических реакций было узаконено применение симультанной пробы с ППД-туберкулином для млекопитающих и КАМ. А в соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» от 12.11.2002 г. Для дифференциации аллергических реакций применяется симультанная проба с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц.

Кроме того, для дифференциации неспецифических реакций применяется пальпебральная проба (туберкулин вводят в толщу нижнего века). В целях отбора животных для диагностического убоя (из числа реагирующих животных) используют глазную и внутривенную туберкулиновые пробы.

Применение комплекса указанных методов диагностики туберкулеза позволяет дифференцировать аллергические реакции и предотвратить необоснованный убой большого количества реагирующих животных с неспецифическими реакциями на туберкулин.

2.3. Атипичные (нетуберкулезные) микобактерии

В последние десятилетия повсеместно практически во всех странах из биоматериала людей и животных и из проб окружающей внешней среды стали выделять культуры микобактерий, которые по некоторым признакам существенно отличались от истинных микобактерий туберкулеза. Эти различия в основном касались некоторых культуральных и биохимических свойств, а также патогенности для животных и человека.

История выявления атипичных микобактерий показывает, что первые сообщения о выделении атипичных микобактерий были уже в 30-х годах. Так, S. Cummings, J. Williams (1933), A. Pinner (1935) сообщали о выделении из лимфатических узлов, мокроты и гноя культур микобактерий, которые обладали способностью пигментообразования, быстрым ростом, но не обладали патогенностью для морских свинок.

J.Vallier, A. Betroye (1934) рассматривали выделение атипичных микобактерий как простое загрязнение питательных сред.

M. Lester (1939) сообщала о выделении 130 культур микобактерий из организма человека, из которых 55 оказались пигментообразующими.

J. Y. Weissfeiler (1973) выделял атипичные микобактерии и ассоциации с возбудителем туберкулеза.

В дальнейшем, постоянные исследования объектов внешней среды, воды, почвы, продуктов питания, экскретов человека и животных привели к выявлению значительного количества кислоустойчивых микобактерий. Эти микобактерии не вызывали заболевания у экспериментальных животных и с медицинской точки зрения расценивались только как любопытные лабораторные находки. Тем не менее, в печати стали появляться и описания неидентифицированных микобактерий, которые не принадлежали к микобактериям туберкулеза, но были патогенными для людей.

Поводом для более углубленного изучения атипичных микобактерий послужили сообщения об их этиологической роли при некоторых заболеваниях человека, иногда заканчивающихся летально. Так, в 1948 г. P. Maccallum с соавт. выделили из кожных язв людей в 6 случаях микобактерии, которые выделяли и из воды плавательных бассейнов, где происходило инфицирование кожных покровов. Автор дал название этому возбудителю M. Ulceros. Эти культуры росли довольно медленно, образовывали бледно-желтый или оранжевый пигмент, проявляли патогенность в отношении крыс и мышей.

V. Buhler, A. Pollack (1953, 1955) описали случаи летального исхода у людей с заболеваниями, клинически неотличимыми от туберкулеза. При этом они выделяли сравнительно быстрорастущие пигментированные культуры, патогенные для сирийского хомяка, которых назвали yellow bacillus, а затем по месту их первоначального выделения – M. Kansasii (штат Канзас, США).

Позже L. Wood (1956) выделил культуру M. Kansasii из организма 16 больных людей, из которых 6 умерли.

Эти микобактерии впоследствии получили название анонимных, оппортунистических, неклассифицированных, неидентифицированных, нетуберкулезных, анормальных, атипичных микобактерий (J. Chapman, 1960; P. Juhass, M. Caucas, 1973 и др.).

А.М. Хома–Лемешко (1964) указывал, что в связи с генетической близостью микобактерий термин «атипичные» микобактерии является самым подходящим.

J.Y. Weissfeiler (1975) также считал более правильным пользоваться термином «атипичные микобактерии», так как этим подчеркивается их отличие от типичных возбудителей туберкулеза (M. Tuberculosis и M.Bovis).

Термином «атипичные микобактерии» продолжают пользоваться и в настоящее время. Однако, бактериологические и молекулярно генетические свойства характеризуют их как типичных представителей рода Mycobacterium. В 90-е годы XX столетия предложен более нейтральный для этой группы термин «нетуберкулезные микобактерии» (НТМБ).

Интерес к атипичным микобактериям в последние годы обусловлен с одной стороны – необходимостью дифференцировать их от микобактерий туберкулеза, а с другой стороны тем, что их связывают с заболеваниями, схожими с туберкулезом. По мнению J. Mark, D. Troloppe (1960), эти заболевания правильно было называть «микобактериальным псевдотуберкулезом».

В настоящее время нет никаких сомнений, что атипичные микобактерии являются причиной поражения у людей легких, лимфатических узлов и некоторых других органов.

Вопрос об атипичных микобактериях впервые широко обсуждался в 1959 г. в Турции на Международной конференции по туберкулезу. Значение атипичных микобактерий в клинике туберкулеза было предметом обсуждения на международных конференциях и симпозиумах: в 1962 г. в США, в 1971 г. в Венгрии, в 1971 г. в СССР, в 1972 г. в Польше, в 1975 г. в Чехославакии, в 1978 г. в Польше.

Атипичные микобактерии повсеместно распространены в природе (F. Linell, A Norden, 1954; G. Kubica et al., 1961; И.А. Каркадиновская, 1961; Г.П. Славина, 1964; В.И. Шоршнев, 1964; R. Jones, D. Jenkins, 1965; J. Kazda, 1966, 1967; Т.Г. Зименко, 1966; И.К. Норенкова, 1966; Г.А. Юдин, 1967; В.В. Судаченков, 1969; В.С. Тырина, 1969; А.Н. Шаров, 1970; Л.А. Ищенко, 1975; А.М. Кадочкин, 1979; А.В. Ткачев-Кузьмин, 1982; В.И. Кудяков, 1984; Ю.Я. Кассич с соавт., 1985; В.Е. Щуревский с соавт., 1984; Г.К.Параскевов, 1988; Н.П. Овдиенко, 1991; Р.А. Нуратинов, 1998; М.В. Качкин, 2007; А.С.Донченко с соавт., 2004; Н.И. Прокопьева, 2004; Н.Г. Толстенко, 2006; В.Г. Ощепков с соавт., 2003; Н.С. Боганец, 2006; А.Х. Найманов с соавт., 2010; Н.Н. Кошеев с соавт., 2011 и др.).

Считается, что заражение крупного рогатого скота атипичными микобактериями происходит, в основном, через загрязненные ими корма и воду (E. Freerksen, D. Lauterbach, 1960; E. Freerksen, 1962).

Предполагается, что заражение крупного рогатого скота атипичными микобактериями не оказывает существенного влияния на состояние здоровья животного, но вызывает лишь кратковременную сенсибилизацию и туберкулиновую аллергию, сохраняющуюся в основном на протяжении 3-8 месяцев. При повторных исследованиях стада у многих животных наблюдается выпадение реакций и появление их у других (О.В. Мартма, 1966, 1977, 1982).

Установлено, что развитие чувствительности к туберкулину и возникновение заболевания зависит от вида, дозы и вирулентности возбудителя, возраста животного, состояния защитных сил микроорганизма, а также от предрасполагающих факторов. Так, ослабление сопротивляемости организма, дисбактериоз и т.д. способствует тому, что микобактерии приживаются в организме крупного рогатого скота и обусловливают кратковременную сенсибилизацию его к туберкулину (О.В. Мартма, 1967).

Частота выделения и ареал распространения атипичных микобактерий разнообразен.

Г.А. Параскевов (1988) указывает, что при ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота увеличивается выделение атипичных микобактерий от реагирующих на туберкулин животных. Так, при исследовании 1033 проб биоматериала от реагирующих животных в 63 случаях выделены микобактерии: из них 4 (6,3%) - патогенные, 59 (93,6%) – атипичные, Причем, основную массу (до 77,7%) составляли атипичные микобактерии 4 группы по Раньону.

Н.С. Боганец (2006) указывает, что в РФ ветеринарными лабораториями выделены атипичные микобактерии в следующем составе: 4 гр. по Раньону – 59,2%; 3 гр. – 14,7%; 2 гр. – 22,3%; 1 гр. – 3,9%. Из организма крупного рогатого скота в Сибирском регионе наиболее часто выделяют: M. Phlei – 12,5%, M. Peregrinum – 11,1%; M. Smegmatis – 10,1%; M. Fortuitum – 8,3%.

М. В. Качкин (2007) указывает, что в благополучных стадах крупного рогатого скота Новосибирской области выделяются атипичные микобактерии 1 гр. по Раньену 3,1%, 2 гр. – 15,6%., 3 гр. – 12,5% и 4 гр. – 65,7%.

А.В. Скрыпник (2007) при изучении видового состава 125 изолятов микобактерий из 11 областей Украины выделил M. Avium (34%), M. Fortuitum (31%), M.Phlei (13%), M. Nonchromogeicum (6%), остальные виды атипичных микобактерий были представлены единичными изолятами (до 2%).

Н.И. Прокопьева (2004), Н.А. Обоева (2010) в благополучных по туберкулезу хозяйствах Якутии от реагирующих на туберкулин животных и объектов внешней среды выделяли 11 видов атипичных микобактерий 1-4 групп по Раньону, но максимальную значимость имела сенсибилизация животных быстрорастущими атипичными микобактериями 4 гр. по Раньону, среди которых доминировала M. Vaccae, что является особенностью региона Якутии.

Данные о патогенности атипичных микобактерий для животных также противоречивы. Однако, большинство исследователей считают, что атипичные микобактерии не вызывают патоморфологических изменений у крупного рогатого скота.

Тем не менее, в доступной литературе имеются сообщения некоторых авторов, что при убое реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота иногда выявляются незначительные подобные для туберкулеза изменения. Так, О.В. Мартма, К.К. Тяхнас (1978) при убое реагирующего крупного рогатого скота в лимфатических узлах кишечника в 4,6% случаях находили незначительные изменения, подобные для туберкулеза. При культуральном исследовании этих животных были выделены атипичные микобактерии.

По данным Р.В. Тузовой (1983) наибольшие поражения могут возникать при заражении животных атипичными микобактериями I и III группы по Раньону.

Среди различных видов микобактерий, вызывающих туберкулезоподобные изменения в лимфатических узлах и легких, авторы наиболее часто указывают на M. Avium, M. Kansasii, M. Intracellularae, M. Xenopi, M. Fortuitum (Е. И. Шуцкая, 1965; Т.Б. Ильина, 1967; А.И. Каграманов, 1971; Е.А. Рабухин, 1972; Р.О. Лотоцкая, 1986).

2.4. Классификация микобактерий

Классификация микобактерий началась еще в 1986 г., когда Lehman и Neuman устанавили род Mycobacterium. Определяющими свойствами рода были морфологическая характеристика и устойчивость к обесцвечиванию кислотой и щелочью.

В «Определителе бактерий Д. Берджи», изданном в 1957 году, было описано только 14 видов микобактерий, а в определителе 1974 года проводилось описание уже 30 изученных и 11 изучаемых видов микобактерий. По данным O. Takimura, J. Tompson (1969) насчитывается до 200 видов микобактерий, а по данным J.Y.Weiszfeiler (1975) – около 50 видов микобактерий.

В «Определителе бактерий Берджи» 1986 г. род микобактерий представлен 54 видами. Последнее издание «Определителя бактерий Берджи» (1997 г.) включает 45 видов и комплексов микобактерий. Такой разброс данных свидетельствует о том, что классификация и систематика микобактерий продолжается, а также продолжается выявление и описание новых видов микобактерий.

В настоящее время наибольшее признание и распространение получила классификация атипичных микобактерий, разработанная Е. Раньоном (E. Runyon) в 1959 году. В основу его классификации были положены показатели скорости и характера роста культур микобактерий на питательных средах, способность к пигментообразованию, рост при различных температурах. В соответствии с этими признаками микобактерии были разделены на четыре группы.

Группа I - фотохромогенные, образуют желтый пигмент только при культивировании на свету. Растут при температуре 37 и 25оС, обладают определенной патогенностью. Растут в течение 3-6 недель.

Группа II - скотохромогенные, образуют желто-оранжевый цвет при культивировании на свету и в темноте. Составляют самую большую группу (от 60 до 70) микобактерий.

Группа III.- нефотохромогенные, т.е. безпигментные виды. Эти микобактерии имеют наибольшее значение в инфицированности сельскохозяйственных животных, а также в этиологии микобактериозов у человека.

Группа IV- быстрорастущие, отличаются быстрым ростом при различных температурных режимах. Широко распространены во внешней среде и природе.

Группы атипичных микобактерий и их основные представители

Группы Характеристика Виды микобактерий

Роста пигментообразования 1 Медленнорастущие Фотохромогенные - образуют пигмент только при освещении M. Kansasii

M. Marinum

M. Simiae

2 Медленнорастущие Скотохромогенные – образуют пигмент при освещении и без освещения M. Scrofulaceum

M. Gordonae

M. Czulgai

M. Xenopi

3 Медленнорастущие Нефотохромогенные – непигментированные M. Avium

M. Intracelluarae

M. Gastri

M. Nonchromogenicum

M. Triviale

M. Terrae

4 Быстрорастущие (растут в течение 3-5 суток) Пигментированные и непигментированные M. Chelonei

M. Fortuitum

M. Smegmatis

M. Pheli

M. Vaccae

M. Peregrinum

M. Borstelense

Частота выделения атипичных микобактерий из патматериала убитых животных по данным разных авторов составляет от 5 до 37%.

2.5. Сенсибилизирующие свойства атипичных микобактерий.

Несмотря на многочисленные исследования и достаточное количество публикаций, до настоящего времени сложно ответить на вопрос - когда, какие виды и при каких условиях атипичные микобактерии могут вызывать сенсибилизацию крупного рогатого скота к туберкулину.

Так, Н.П. Овдиенко, В.И. Косенко, А.Х. Найманов, А.М. Кадочкин, Б.И. Антонов, М.И. Гертман (1990) указывают, что атипичные микобактерии широко распространены в природе и их можно выделить из различных объектов внешней среды. Однако, не ясны, причины при которых проявляется сенсибилизация крупного рогатого скота атипичными микобактериями. Авторы полагают, что неоднократное поступление значительного количества атипичных микобактерий и изменение физиологического состояния организма животных под влиянием неблагоприятных условий содержания способствует такой сенсибилизации, и у животных происходит иммунобиологическая перестройка.

Н.Н. Кошеев, В.Ф. Бордюг, В.Г. Ощепков, А.Д. Панкратов, А.Д. Слепченко (2011) считают, что при изучении сенсибилизирующих свойств, введение атипичных микобактерий в дозе 1 мг/мл часто не вызывает ответной реакции у морских свинок и не дает возможности качественно оценить способность сенсибилизировать организм хозяина-носителя. Авторы предлагают последовательное (дробное) трехкратное введение культур атипичных микобактерий в дозе 20 мг/мл – в целях повышения их сенсибилизирующих свойств.

Таким образом, представленные литературные данные показывают, что сенсибилизирующее значение атипичных микобактерий требует дальнейшего изучения.

Первые сообщения о сенсибилизирующем действии микобактерий 1 гр. по Раньену появились в 50-60-х годах. V. Suhler, A. Pollack (1955), E. Runyon (1959), E. Freezsken (1960), J.K.Weisfeiler (1975) экспериментально доказали, что сенсибилизация объясняется близким антигенным родством фотохромогенных микобактерий с возбудителем туберкулеза. Такое близкое генетическое родство было использовано и в опытах по изучению способности атипичных микобактерий иммунизировать животных против туберкулеза.

G. Youmane (1961) на белых мышах, Н. Кассирская (1965) на морских свинках установили, что некоторые фотохромогенные культуры M. Kansasii обладают выраженной иммуногенностью. Причем, если принять иммунизирующий эффект БЦЖ за 100%, то у M. Kansasii он равнялся за 85%.

V. Mallmann, W. Mallmann, P. Robinson (1964) выделили от КРС и свиней 2 культуры M. Kansasii. Одна культура была выделена из измененного лимфатического узла реагирующей на туберкулин коровы, вторая - из печени свиньи.

R.W. Worthington, H. Kleeberg (1967) в Южной Африке выделили от двух реагирующих на туберкулин коров культуры фотохромогенных микобактерий. Эти микобактерии также выделяли из внутренних органов убитых в Англии коров.

T. Schliesser (1967) выделил фотохромогенные культуры M.Kansasii из измененных лимфатических узлов кишечника.

L. Garual-Rodriges (1972) от крупного рогатого скота без признаков туберкулеза выделил 2 культуры M. Kansasii.

M. Janwie (1972) выделил M. Kansasii из проб молока от нереагирующих на туберкулин коров.

В.В. Судаченков (1969) в опыте на 6-10 месячных бычках при подкожном и интраназальном заражении их фотохромогенными культурами микобактерий 1 гр. по Раньону установил, что эти микобактерии не обладают сенсибилизирующими свойствами и только в исключительных случаях могут считаться причиной неспецифических реакций у крупного рогатого скота.

В.С. Тырина (1969) при изучении сенсибилизирующих свойств фотохромогенных культур микобактерий наблюдала реакции на введение туберкулина через 44-65 дней после заражения. Аллергические реакции у зараженных телят были более выраженными и продолжительными на туберкулин для млекопитающих, чем на туберкулин для птиц.

Л.А. Ищенко (1975) при заражении телят фотохромогенными культурами отмечала более выраженные реакции на птичий туберкулин, чем на туберкулин для млекопитающих.

Ю.Я. Кассич с соавт. (1985) установил, что M. Kansasii, введенные бычкам per os с интервалом в 30 дней в дозе 0,05 и 0,1 мг/кг, вызывают временную сенсибилизацию к туберкулину через 30 дней после последнего заражения.

Что касается фотохромогенных микобактерий M. Marinum, выделенных от рыб, сведений об их сенсибилизирующих свойствах у крупного рогатого скота мы не обнаружили.

Таким образом, сведения о сенсибилизирующих свойствах фотохромогенных микобактерий 1 гр. по Раньону немногочисленны и противоречивы, и этот вопрос требует дальнейшего изучения.

На сенсибилизирующую роль скотохромогенных микобактерий 2 гр. указывают многие авторы.

В.С. Тырина (1969) при заражении телят различными видами микобактерий, установила, что животные, зараженные скотохромогенными микобактериями, реагируют на туберкулин. Но через 9 месяцев эти реакции исчезают.

В.В. Судаченков (1969) в опыте на телятах установил, что микобактерии 2 гр. по классификации Раньона не играют существенной роли в сенсибилизации крупного рогатого скота к туберкулинам и только в исключительных случаях могут быть причиной проявления неспецифических реакций.

Kocula (1975) указывает, что при сенсибилизации скотохромогенными микобактериями, на ППД туберкулин для млекопитающих и ППД для птиц реагирует до 70% крупного рогатого скота. Применение сенситинов дает гораздо лучшие результаты.

M. Janowiec (1972) в результате опытов на крупном рогатом скоте установил, что скотохромогенные микобактерии являются причиной аллергической перестройки организма животных.

Н. Савов (1975) установил, что инфицированные M. Aguae коровы реагируют на туберкулин. Причем, на туберкулин для птиц реагируют более интенсивно чем для млекопитающих.

D. Fritchard, G.Stanford, D. Faul (1976) в Уганде установили способность M. Gordonae вызывать аллергические реакции к туберкулинам у крупного рогатого скота. Однако реакции на туберкулин для млекопитающих и для птиц были незначительными. Авторы рекомендуют применять сенситины, действие которых более специфично.

С. Person (1977) проводил заражение крупного рогатого скота различными культурами атипичных микобактерий и установил, что M. Flavescens и M. Gordonae вызывают сенсибилизацию организма животных. Так, через 76 дней после заражения реагировали только животные, зараженные M. Flavescens.

Н.А. Александров (1973) установил, что длительное алиментарное скармливание крупному рогатому скоту M. Gordone не вызывает сенсибилизацию организма животных к туберкулинам.

К. Михайлова с соавт. (1977) наблюдали неспецифические реакции у завезенного племенного крупного рогатого скота. Реакции выпали через 3,5 месяца. При бактериологическом исследовании патматериала от убитых реагирующих животных выделили скотохромогенные микобактерии (вид не установлен).

Ю.Я. Кассич с соавт. (1985) установили, что M. Scorfulaceum, введенные per os с интервалом 30 дней в дозе 0,05-0,01мг/кг, обусловливают временную сенсибилизацию телят к туберкулину через месяц после последнего заражения микобактериями.

Представленные данные показывают, что большинство авторов считают, что скотохромогенные микобактерии 2 гр. Раньона могут вызывать сенсибилизацию телят к туберкулину через месяц после последнего заражения микобактериями.

О сенсибилизирующем действии 3-ой группы микобактерий известно давно. Так, представитель этой группы M. Avium является одной из микобактерий, чья роль в возникновении неспецифических реакций достоверно установлена. Первые сообщения об этом были сделаны Rivolta (1889), Strause (1891), Strenberg (1892), Pansini (1894), O. Bang (1908) и др.

На IX Международном ветеринарном конгрессе в 1909 г. в Гааге был заслушан доклад Р. Эрлонга с соавт., о выделении микобактерий птичьего вида от крупного рогатого скота.

В последующие годы вопросу инфицирования крупного рогатого скота M. Avium стали придавать все большее значение, так как неспецифические реакции значительно усложнили аллергический метод диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота и одновременно систему мероприятий по борьбе с этой инфекцией.

Над этой проблемой много работал K. Plum (1931,1937), который установил, что в благополучных, но инфицированных M. Avium хозяйствах до 100% животных могут реагировать на туберкулин для млекопитающих.

W. Feldman et al. (1939, 1942) сделал заключение, что заражение крупного рогатого скота возбудителем M. Avium не всегда связано с больными курами, а может быть следствием контакта с инфицированными свиньями или дикой птицей.

А. Д. Карлсон (1962) указывал, что M. Avium обладает самой значительной способностью сенсибилизировать организм животных и тем самым является основной причиной проявления неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота.

В. В. Судаченков (1969) установил, что микобактерии 3 гр. способны сенсибилизировать крупный рогатый скот и должны рассматриваться как основная причина выявления неспецифических реакций на туберкулин у животных.

Ю.Я. Кассич с соавт. (1985) установил, что M. Intracelluarae, введенная алиментарно бычкам в дозе 0,05-0,01 мг/кг с интервалом 30 дней, вызывает временную сенсибилизацию к туберкулину через месяц после последнего заражения.

Следует указать, что в связи с дальнейшем изучением M. Avium стали появляться сообщения, указывающее, что не все культуры, проявляющие культуральные и биохимичиские свойства M. Avium, могут быть причислены к микобактериям птичьего вида, т.к. они не патогенны для кур и кроликов.

Так, A.Meyn в 1961 г. в докладе на Австрийском обществе ветеринарных врачей назвал эти микобактерии «птичьеподобными» и указал, что эти птичьеподобные микобактерии могут вызывать в лимфоузлах брыжейки свиней изменения, неотличимые от туберкулезных поражений.

Речь шла о так называемых микобактериях БЭТТИ, которые впервые были описаны, J.Cuttino, A.McCabe (1949), как Nocardia Intracellularis. В дальнейшем Е. Раньон (1965) назвал их M. Intracellulararae и поместил в 3 группу нефотохромогенных микобактерий.

W. Schaefer (1965) разработал метод прямой агглютинации нефтохромогенных микобактерий, который позволил разбить на серотипы комплекс микобактерий Avium – Intracellulararae.

Анализ литературы показывает, что не все серотипы микобактерий комплекса avium – intracellulararae обладают сенсибилизирующими свойствами. Однако в опубликованных работах нет данных, с какими серотипами работали авторы.

В дальнейшем стали появляться работы, в которых авторы наряду с описанием выделенных культур M. Avium – Intracellulararae приводят и серотипическую характеристику.

M. Tsukamura (1977) установил, что 94% всех микобактерий комплекса Avium – Intracellulararae, выделенных от свиней, составляют серотипы 3,4,6,8,9,11, тогда как у человека на эти серотипы приходятся только 28% выделенных культур. На этом основании автор делает предположение, что свиньи не являются источником заражения у людей.

W. Schaefer (1967) провел идентификацию 172 культур нефотохромогенных микобактерий и получил следующие результаты: серотип 1-13 культур, серотип 2-81, серотип 3-19, серотип 4-10, серотип 5-6, серотип 6-1, серотип 7-10, серотип 8-14, серотип 9-9, серотип 12-13, серотип 14-2, серотип 16-3. Одну культуру типировать не удалось.

T. Shliesser (1977) в качестве подтверждения тому, что главным источником инфекции комплекса Avium – Intracellulararae является домашняя и дикая птица приводит положение о том, что у крупного рогатого скота и свиней преобладает серотип 2, который чаще всего выделяют от больных туберкулезом кур.

Из данных литературы видно, что различные виды животных являются носителями самых различных серотипов микобактерий комплекса avium – intracellulararae. Без уточнения серотипов и изучения сенсибилизирующих свойств этих серотипов сложно проводить дальнейшие исследования по изучению причины неспецифических реакций на туберкулин.

Одним из первых сенсибилизирующие свойства быстрорастущих микобактерий 4 группы изучал A. Crawford (1926, 1928), наблюдая выраженные реакции на туберкулин для млекопитающих у зараженных M. Phlei морских свинок. Однако у инфицированного этой же культурой крупного рогатого скота вызвать реакции не удалось.

E. Hastings (1930, 1936) наблюдал у крупного рогатого скота перекрестные реакции на туберкулин при введении быстрорастущих микобактерий.

W. Hagan (1931) получил аналогичные результаты с M. Phlei.

C. Buxton, R. Glover (1939) установили, что M. Phlei не вызывает сенсибилизации у крупного рогатого скота.

A. Karlson, W. Feldman (1940) при заражении морских свинок, кур, кроликов и телят быстрорастущими микобактериями установили, что кратковременные реакции на гомологичный и птичий туберкулины удается вызвать только у морских свинок. У остальных животных при сенсибилизации организма этими же культурами микобактерий реакции не наблюдали.

M. Tarshish, A.Frish (1952) указывают, что животные, инфицированные M. Phlei, M. Smegmatis и M. Butyricum не реагируют на введение гомологичных и гетерологичных видов ППД туберкулинов.

G. Bederke (1954), M.Ptalsgrat (1955), D. Kushner (1957) доказали, что быстрорастущие микобактерии вызывают яркие аллергические реакции у морских свинок и кроликов.

H. Muller, O. Kollman (1956) сообщили, что M. Phlei и M. Lacticola не вызывают туберкулиновой чувствительности у крупного рогатого скота при экспериментальном заражении, даже если их вводят повторно и в больших дозах. Согласно полученным данным, авторы предполагают, что в естественных условиях такая масса микобактерий не может попасть в организм животного, а следовательно, не могут возникнуть и парааллергические реакции на туберкулин.

A. Meyn (1962) установил, что M. Phlei и M. Smegmatis не вызывают туберкулиновой чувствительности у крупного рогатого скота при введении в больших дозах энтерально и парэнтерально.

E. Freerksen, D. Lauterbach (1961) установили, что из пяти телят, инфицированных M. Fortuitum, только один дал положительную реакцию, а из трех животных, инфицированных M. Smegmatis, два теленка реагировали сомнительно, а один не реагировал. При инфицировании трех телят M. Phlei у двух наблюдали положительные и у одного – отрицательные реакции.

По данным J. Szabo (1963) у крупного рогатого скота, зараженного быстрорастущими микобактериями, состояние сенсибилизации не наступало, или же реакции проявлялись только на гомологичный аллерген (сенситин).

В.И. Шоршнев (1965) сообщает о выделении им 8 культур кислоустойчивых быстрорастущих микобактерий из подстилочного торфа. При изучении двух из этих культур оказалось, что они не вирулентны для морских свинок, кроликов и кур, а также не вызывали аллергии у кур.

Некоторые авторы установили, что атипичные быстрорастущие микобактерии могут вызывать аллергические реакции у животных, если они вводятся в организм суспендированными в жирах.

A. Canham (1944) введением масляных эмульсий M. Phlei телятам вызывал состояние сенсибилизации на ППД туберкулин для млекопитающих.

K. Green (1946) также считал, что у морских свинок, зараженных M. Phlei в масле, можно вызвать аллергические реакции на туберкулины, но для этого потребуются большие дозы микобактерий.

H. Jonson et. al (1949) сообщают, что M. Phlei в парафине, у крупного рогатого скота вызывает аллергические реакции на туберкулин, но эти реакции слабо выраженные и удерживаются в течение непродолжительного времени.

Другие исследователи, напротив, в своих наблюдениях указывают на возможность сенсибилизации организма лабораторных животных и крупного рогатого скота атипичными быстрорастущими микобактериями.

A. Mein (1953) указывал на выделение из кормов M. Phlei и M.Lacticola, которые могут вызывать временную групповую аллергию на туберкулин для млекопитающих у крупного рогатого скота. При заражении морских свинок культурой M. Phlei у них наблюдали слабо выраженные реакции на бычий туберкулин и более выраженные на птичий.

P. Stuart, P. Harvey (1951) отмечали, что крупный рогатый скот естественно и искусственно зараженный M. Lacticola, положительно реагирует на очищенный аллерген из этого микроорганизма.

H. Muller (1954), заражая морских свинок культурой M. Phlei, наблюдал слабо выраженные реакции на бычий туберкулин и более интенсивные – на птичий.

M. Seelman, N. Rakov (1955), проводившие сравнительное изучение аллергенных свойств на морских свинках и телятах M.Lacticola и M. Phlei, указывали на тесную взаимосвязь их антигенов. Аллергические реакции возникали как на гомологичные, так и гетерологичные туберкулины.

A. Hoblinger (1955) после интраперитональной инъекции культур M. Phlei и M. Lacticola у морских свинок наблюдал непродолжительные параллаергические туберкулиновые реакции.

G. Bederke (1954), D. Ptalzgrat (1955) доказали, что быстрорастущие микобактерии вызывают аллергические реакции у морских свинок и кроликов.

D. Kushner et al. (1957) показали, что после введения культуры M. Fortutium, кролики не реагировали на туберкулин из человеческого вида микобактерий, но положительно реагировали на бычий и птичий туберкулины и на аллерген из гомологичных культур, причем на последней реакции были сильнее.

J. Lesslie (1960) сообщил, что инфицированные M. Fortuitum, M. Phlei, M. Smegmatis телята и коровы реагировали только на ППД из гомологичного штамма микобактерий. Морские свинки при заряжении M. Smegmatis одинаково реагировали на ППД-смегматин.

E. Freeksen, D. Lauterbach (1961) установили, что при скармливании телятам M. Fortuitum, M.Phlei и M. Smegmatis, суспендированных в молоке, возникали аллергические реакции на бычий туберкулин. На гомологичные аллергены реакции были выраженными и продолжительными.

W. Helschen, K. Kruger (1963) при подкожном заражении крупного рогатого скота культурой M. Smegmatis удалось вызвать чувствительность к туберкулину, которая возникла через 6 недель после заражения и наблюдалась в течение 4 месяцев.

Г.А. Юдин (1965) изучал сенсибилизирующие свойства пяти культур быстрорастущих микобактерий на крупном рогатом скоте и установил, что слабо выраженные реакции возникали в течении от 48 дней до 7 месяцев и через 1,5-2,5 месяца выпадали.

И.В. Поддубский (1965), M. Pavlas (1965, 1967), А.М. Говоров с сотр. (1967) изучая сенсибилизирующие свойства культур M.Phlei, M. Smegmatis

M. Fortuitum, и M. Rabinovitsch установили, что при заражении морских свинок и телят, культуры микобактерий (кроме M. Rabinovitsch) вызывали кратковременную реакцию на бычий, птичий и гомологичный туберкулины. Такой же результат получили S. Schmittdiel et al. (1970) при подкожном заражении телят M. Butyicum.

Г. В. Чепик, Н.К. Чурбаков (1966) инфицировали M.Phlei подкожно 5 бычков в возрасте 12-18 месяцев. Через месяц после заражения животные реагировали на бычий и птичий туберкулины.

И.В. Поддубский (1967) считал, что причиной выявления у животных парааллергических реакций могут быть не только атипичные микобактерии первых трех групп по Е. Раньону, но и некоторые виды 4 группы (M. Fortuitum), так как они обусловливают сенсибилизацию организма и некоторые из них индуцируют образование антител, имея антигенное родство с микобактериями туберкулеза.

Th. Schliesser (1965), Th. Schliesser, A Katikevidis (1969) указывали, что фотохромогенные атипичные микобактерии и быстрорастущие M.Phlei, M. Fortuitum, и M. Smegmatis выделяются от крупного рогатого скота довольно редко. Наиболее частой причиной парааллергических реакций у крупного рогатого скота на бычий туберкулин являлись нефотохромогенные микобактерии, которые вызывали у них туберкулезоподобные изменения в лимфатических узлах.

M. Pavlas (1965) при изучении сенсибилизирующих свойств M. Smegmatis, M. Phlei и M. Rabinovitsch у крупного рогатого скота установил, что наиболее выраженную реакцию вызывала M.Phlei, реакция была положительной в течение 6-15 недель.

J. Nyiredy et. al. (1967,1978) при заражении 72 телят несколькими культурами быстрорастущих микобактерий пришли к заключению, что при инфицировании рег os только M. Fortuitum вызывала сенсибилизацию организма телят, что обусловлено лучшей приживаемостью M. Fortuitum в организме животного, по сравнению с M.Phlei, M. Smegmatis, M. Butyicum и M. Peregrinum.

T. Sobiech et al. (1970) проводили заражение бычков M. Phlei и M. Fortuitum. Положительные реакции появлялись через 1-3 месяца после заряжения и сохранялись в течение 1-7 месяцев.

D. Prithard et al. (1974) установили, что M. Fortuitum в меньшей степени, чем M. Chelonei являются причиной неспецифических реакций у крупного рогатого скота и зебу к туберкулину.

А. Савов, В Павлов (1975) заражали 7 коров подкожно 5 мл взвеси M. Fortuitum, M. Vaccae, M. Smegmatis. Через месяц все животные реагировали на туберкулин.

L. Rossi (1975) подкожно сенсибилизировал бычков массой 250-300 кг суспензией M. Kansasii, M. Aquae, M. Intracellularae, M. Fortuitum, M. Phlei в различных дозах. Интенсивнее были выражены реакции на гомологичные туберкулины, по сравнению с гетерологичными.

Б.А. Корж с соавт. (1976) изучали сенсибилизирующие свойства M. Fortuitum, M. Phlei, M. Smegmatis и M. Kansasii. Бычков заражали культурами подкожно в дозе по 50 мг. Авторы установили, что атипичные микобактерии вызывали сенсибилизацию организма телят к туберкулинам. Аллергические реакции на гомологичные туберкулины были хорошо выражены в течение 1-3 месяцев после заражения и исчезали на 165 день.

O. Pearson et al. (1977) проводили заражение крупного рогатого скота M. Flavescens и M. Gordonae с последующей туберкулинизацией через 78 дней после заряжения. По их данным, реакции на птичий туберкулин и сенситин были примерно одинаковыми. На бычий туберкулин реагировали животные, зараженные M. Flavescens.

А. В. Ткачев-Кузьмин (1982) установил, что M. Fortuitum, M. Smegmatis вызывают у морских свинок непродолжительную сенсибилизацию, а на организм крупного рогатого скота не оказывают сенсибилизирующего действия.

В.Н. Кудяков (1983) установил, что M. Phlei, M. Fortuitum, M. Diernhoferi и M. Flavescens при подкожном заражении морских свинок в дозе 1мг/мл вызывали у зараженных животных непродолжительную (до 45 дней) аллергическую реакцию на ППД туберкулин для млекопитающих.

В.Е. Щуревский, Н.П. Овдиенко, А.М. Кадочкин, В.Н. Кудяков (1984) установили, что M. Phlei, M. Diernhoferi, M. Flavescens и M. Fortuitum при скармливании их телятам обладали в разной степени сенсибилизирующими свойствами. Так, через месяц после заражения все животные реагировали на ППД туберкулин для млекопитающих.

Н.И. Прокопьева (2003) установила, что в условиях Крайнего Севера от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота в 75% случаях выделялись атипичные микобактерии 4 группы по классификации Раньона (60,4% из них M. Vaccae).

Т.В. Кандыбина, А.И. Сорокина, Е.Ю. Поливодина (2005) при исследовании 102 проб с объектов внешней среды из неблагополучных и благополучных по туберкулезу хозяйств Амурской области и Приморского края выделили 6 культур быстрорастущих атипичных микобактерий 4 группы по классификации Раньена.

А.С. Донченко, В.Н. Кисленко, Н.А. Донченко, Н.Л. Тупота, Н.М. Колычев, Л.М. Каримова (2011) считают, что основной, а возможно и единственной причиной проявления реакций на туберкулин в благополучных хозяйствах является сенсибилизация крупного рогатого скота атипичными микобактериями. В регионе Западной Сибири, в частности Новосибирской области, причиной парааллергических реакций на туберкулин являются M. Fortuitum и M. Smegmatis.

Н.И. Прокопьева, Г.П. Протодьякова (2013) указывают, что животноводческие хозяйства Республика (Саха) Якутия оздоровлены от туберкулеза и в течении последних десятилетий остается благополучной по туберкулезу крупного рогатого скота. Однако при плановых аллергических исследованиях ежегодно в 15-17 улусах выявляются реагирующие на туберкулин животные с неспецифическими реакциями. При лабораторном исследовании биоматериала от реагирующих животных выделяли атипичные микобатерии I-IV группы по классификации Раньона или грибы рода Aspergiellus. В видовом составе микобактерий максимальную значимость (63,6%) имеют быстрорастущие микобактерии IV группы по Раньону.

Таким образом, приведенные в литературе данные весьма разноречивы. Тем не менее, большинство исследователей высказываются о значительной роли быстрорастущих микобактерий в возникновении неспецифических реакций у крупного рогатого скота.

2.6. Лабораторные методы диагностики туберкулеза животных

Лабораторные исследования включают в себя обнаружение возбудителя туберкулеза методом световой и люминесцентной микроскопии, бактериологический посев и культивирование микобактерий на специальных питательных средах, идентификацию выделенных культур, изучение биохимических свойств, проведение биологических исследований путем заражения лабораторных животных суспензией биологического материала, а также использование биологического метода для определения вида микобактерий при введении культуры.

Недостатком лабораторных исследований является их трудоемкость и длительность. Медленный рост микобактерий вынуждает выдерживать посевы не менее 3 месяцев, биопроба на лабораторных животных также длится 3 месяца и более, а эффективность культуральных исследований не превышает 40%. Последние годы в комплекс лабораторных исследованный внедряется диагностика туберкулёза методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.6.1. Бактериоскопический метод

Сущность метода заключается в выявлении микобактерий туберкулеза путем микроскопии мазков из нативного материала.

Установлено, что для получения положительных результатов микроскопии мазка необходимо наличие в 1 мл биологического материала не менее 50-100 тыс. микобактерий при концентрации микобактерий в пробе ниже определенного значения, вероятность переноса их в мазок и дальнейшее микроскопическое выявление приближается к нулю (Ф.В. Шабанов, 1969; В.Н. Васильев, 1971; Т.Н. Ященко, И.С. Мечева, 1973)

По данным M. Tsucamura, H. Toyama (1984), результаты микроскопии совпадают с результатами культурального метода только в 3,3%.

Микроскопическое выявление микобактерий основано на их характерном свойстве кислоустойчивости, в связи с чем они окрашиваются в красный цвет при окраске по методу Циль-Нильсена. Все виды микобактерий обладают различной степенью кислоустойчивости, которая зависит от содержания в их составе некоторых липидов и миколовых кислот. Наиболее насыщенны миколовой кислотой микобактерии человеческого и бычьего видов. Однако это не может служить критерием для дифференциальной диагностики видов микобактерий (Р.О. Драбкина, 1963; В.Н. Васильев, 1971).

Для увеличения выявляемости применяют различные методы и концентрации микобактерий в исследуемом материале. Наилучшим из них является метод флотации (А.С. Хольцман, 1940; Б.Е. Аркина, 1942; А.А. Клебанова, Л.Е. Скрябина, 1951; Н.Г. Кондюрин с соавт. 1972; Н.М. Колычев, 1980).

Различные усовершенствования метода флотации увеличивало количество обнаруживаемых микобактерий туберкулеза в 1,5-2 раза, а срок исследования сокращался в 2,5 раза (А.М. Говоров с соавт., 1965).

Люминесцентный метод микроскопии, основанный на способности микобактерий, окрашенных флюорохромами, светиться под воздействием сине-фиолетовых лучей, позволяет на 17% повысить выявляемость микобактерий по сравнению с обычной микроскопией и на 8% с методом флотации.

В настоящее время многие исследователи показывают преимущество люминесцентного метода перед обычным прямым исследованием при окраске мазков по Циль-Нильсену (А.А. Клебанова и др., 1962; А.С. Донченко, В.Н. Донченко, 1977; Н.П. Васильева, В.А. Аникин, 1981; Г.Н. Воронкова, 1986 и др.).

По данным О.А. Поляковой (1957), микроскопическое исследование биологического материала люминесцентной микроскопией по сравнению с обычной световой повышает его эффективность на 14-18%, а по данным А.И. Кузина (1982) увеличивает положительные находки возбудителя туберкулеза на 20%, сокращая трудоемкость процесса в 3-4 раза.

Комплексное исследование биоматериала на туберкулез культуральным и иммунофлюоресцентным методами повышает результативность обнаружения микобактерий на 27,6% (Г.А.Гаврилова, 1955) по данным В.С. Голанова (2003) – на 15-18%.

Однако, несмотря на высокую чувствительность люминесцентной микроскопии, существенным недостатком является свойство флюорохрома окрашивать не только микобактерии туберкулеза, но и атипичные микобактерии, что не позволяет проводить их дифференциацию (А.А. Клебанова, 1960; Г.А. Юдин, 1972; Г.К. Ковалев, 1984 и др.).

2.6.2. Культуральный метод

Культуральный метод выявления микобактерий обладает рядом преимуществ по сравнению с прямой и люминесцентной микроскопией. Сущностью этого метода является выделение культур возбудителей туберкулеза и нетуберкулезных микобактерий на специальных питательных средах. В результате размножения микобактерий образуются их скопления и когда они видны невооруженным глазом, их называют макроколониями, если их наблюдают только под микроскопом - микроколониями.

Культуральный метод исследования является надежным и достоверным методом позволяющим решать широкий круг вопросов микобактериологии. С использованием этого метода получают культуру микобактерий, проводят ее идентификацию, определяют вирулентность, биологические, биохимические и другие свойства (Н. М. Макаревич, 1983), а также профиль миколовых кислот и генетических маркеров (Л.П. Бараускенс, 1977; А.Н.Маянский, 2000; Н.М. Колычев, В.Г. Ощепков, 2001).

Микобатериям туберкулеза присущ сравнительно медленный обмен веществ, а следовательно и медленный рост на питательных средах, что предопределяет сложности культурального метода исследований при туберкулезе. Тем не менее, чувствительность культурального намного выше микроскопического, так как позволяет получить положительный результат при наличии в 1 мл исследуемого материала 20-100 микобактерий (Р.О. Драбкина, 1963; А.З. Смолянская, 1967; И.И. Румачик, 1987; В.И. Голышевская, 1997, и др.).

Результативность культурального метода исследования на туберкулез во многом зависит от качества взятия биологического материала, метода консервирования, транспортировки, условий и сроков хранения, предпосевной обработки, используемых питательных сред.

Микобактерии туберкулеза в чистой культуре и в биологическом материале весьма устойчивы к воздействию физических и химических факторов и способны длительно сохранять вирулентность. Они остаются жизнеспособными в течении 2-3 лет при нахождении на питательной среде (А.А.Поляков и соавт., 1970; Н.М. Колычев с соавт., 1987, и др.). По данным Л.М. Моделя (1957), культуры, длительно хранящиеся в термостате без пересева на свежую среду, постепенно снижают жизнеспособность. Старые культуры (свыше 6 мес.) теряют способность к размножению, но сохраняют способность вызывать туберкулез у морских свинок. Спустя 8-10 мес. микобактерии в культуре обычно гибнут.

Умеренное понижение температуры окружающей среды до 0оС удлиняет выживаемость микобактерий, так как в этих условиях замедляются процессы обмена веществ и аутолиза бактерий (Л.М. Модель, 1957).

M. Bovis после 4-х кратного замораживания и оттаивания теряют патогенные свойства для кроликов через 6 мес., и для морских свинок – через 9 мес. (Н.М. Колычев, 1987). По данным С.И. Гельберга и др. (1935), Ю.К. Вейсфейлера (1949), В.Н. Василева (1971), Л.А. Ищенко (1987), выживаемость патогенных и атипичных микобактерий сохраняется до 22 мес. после 10-и кратного замораживания и оттаивания микобактериальной суспензии.

Эффективность культурального метода исследования во многом зависит от качества предпосевной обработки исследуемого материала. Основными требованиями к химическим веществам для обработки диагностического материала являются устойчивое подавление жизнедеятельности посторонней микрофлоры и отсутствие губительного влияния на микобактерии.

Левенштейн и Сумиоши в 1924 г. впервые установили, что невысокие концентрации кислот и щелочей убивают сопутствующую постороннюю микрофлору и не влияют на жизнеспособность микобактерий. После этого открытия стало возможным изолировать культуры микобактерий из патологического материала. Е.А. Школьникова (1948), А.Н. Маккавейская (1953), В.И. Косенко и соавт. (1984) считают, что 10-15-20% концентрация серной и соляной кислот не снижают у микобактерий способность к росту на питательных средах.

По мнению А.П. Аликаевой (1963), А.И. Кузина (1982), для предварительной обработки свежего биоматериала достаточно использовать 2-4%, а сильно загрязненного 8-10% растворы серной кислоты.

В химической структуре атипичных микобактерий содержится меньше липидов, и они не менее устойчивы к действию кислот и шелочей (Л.М. Модель, 1952; Р.В. Тузова, 1983). Для повышения высеваемости культур атипичных микобактерий рекомендовано снижать концентрацию серной кислоты при обработке материала до 3-4% (Г.К. Параскевов, 1988).

При обработке биоматериала от крупного рогатого скота эффективнее использовать 5-10% растворы серной и соляной кислот или 10% раствор щавелевой кислоты с экспозицией 20-40 минут (А.М. Кадочкин с соавт., 1984; Н.М. Тажгалиев, 1987; В.Е. Щуревский с соавт., 1987). При этих концентрациях кислот высеваемость микобактерий составляет 32-38,4%.

В последние годы для предпосевной обработки биоматериала некоторые авторы предлагают использование фермантативно-деконтаминирующей смеси, состоящей из препарата «Плевасепт» и протеологического фермента «Иммозимаза» (А.Л. Лазовская, Л.С. Финкельштейн, 2000), а также 0,1% раствор препарата «Лесептик» (Е.А.Ильина с соавт., 2002).

Кроме того с целью повышения индикации возбудителя туберкулеза предложен электрофоретический метод предпосевной обработки биоматериала, позволяющий в три раза получить больше культур микобактерий за счет их концентрации (А.Н. Байгазанов и др., 2002; А.Н. Байгазанов, Т.Н. Касымбекова, 2002, 2003; Т.Н. Касымбекова с соавт., 2004).

Основную роль в культуральном методе исследования на туберкулез играют свойства специальных питательных сред.

Впервые чистую культуру микобактерий туберкулеза получил Р.Кох в 1884 году при культировании на свернутой при 68оС бычьей сыворотке крови. Через 10-15 дней после посева патологического материала Кох наблюдал под лупой на поверхности среды маленькие полупрозрачные колонии (Р.О. Драбкина, 1963).

Для культирования микобактерий используют плотные, жидкие и полужидкие питательные среды; по композиционному составу – синтетические и полусинтетические. В.А. Аникин (1987) вводит понятие “полуплотная” питательная среда.

Широкое применение в микобактериологической практике получили плотные питательные среды, имеющие сложный композиционный состав – Hohna, Stonebrink, Левенштейна-Йенсена, Гельберга, Петраньяни (Н.С. Боганец, 1988). На совершенствование этих и создание новых аналогичных сред в различные периоды были направлены усилия многих исследователей.

Более информативные результаты можно получить, используя одновременно две (Э.Р. Финн с соавт., 1979) или несколько (В.И. Гольшевская, 1986) различных по составу сред. В.А. Аникин (1979) рекомендует совместное использование среды Финн-2 со средами, разработанными в Московском НИИ туберкулеза.

К комплексу сред Левенштейна-Йенсена и Финн-2 дополнительно рекомендуется применение среды Аникина №6, содержащую в качестве источника азота продукты микробного синтеза, что обеспечивает репродукцию штаммов с нарушенным метаболизмом. Эта среда по ростовым качествам не уступает средам Финн-2 и Левенштейна-Йенсена и увеличивает частоту находок на 12,1% (К.А. Левина, 1988).

В.Н. Донченко с соавт. (1988), А.С. Донченко, В.Н. Донченко (1994) установили, что M. Bovis и M. Tuberculosis интенсивнее растут на среде Финн-2 и картофельной среде Павловского. Для M. Smegmatis и M. Fortuitum предпочтительны среды Финн-2 и Гельберга, а для M. Intracellulare – среда Павловского.

Разработаны новые плотные питательные среды, состоящие из минерального комплекса, представляющего собой вытяжку из золы древесины березы в концентрации 14% и 0,1%-й оксидат торфа, являющиеся биостимуляторами роста микобактерий (В.Н. Донченко, С.В. Ионина, 2001; С.В. Ионина, 2001; В.Н. Донченко с соавт., 2002) Авторы показали, что предложенная среда по диагностической эффективности превосходит известные коммерческие среды Финн-2 и ФАСТ-ЗЛ, так как рост первых генераций микобактерий из биологического материала появляется на ней на 5,6 дня раньше.

Л.А. Ерошенко с соавт. считают, что оптимальными вариантами для культирования M. Bovis, M. Avium и атипичных микобактерий являются среда Левенштейна-Йенсена, RTT-102 фирмы Oxoid GMBH и среда ФАСТ-3л для M. Paratuberculosis – среда ФАСТ-3л с добавлением фактора роста микобактина.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют, что в медицине и ветеринарии постоянно предпринимаются многочисленные попытки исследователей по совершенствованию методов предпосевной обработки биоматериала и созданию оптимальных вариантов питательных сред для выделения микобактерий.

2.6.3. Биологический метод.

Биологический метод исследования при туберкулезе применяется с момента открытия этой инфекции и не потерял своего значения и до настоящего времени. Сущность метода заключается в воспроизведении туберкулеза у лабораторных животных для выделения возбудителя и определения вида микобактерий. Этот метод является достоверным диагностическим методом диагностики туберкулеза (А.П. Аликаева, 1950; Р.О. Драбкина, 1963; Е.А. Финкель, Л.В. Михайлова, 1976; Е.А.Финкель, Ю.Б. Погребинская, 1977; А.И. Кузин, 1982; М.А. Сафин с соавт.; 1985 и др.).

Биологическая проба дает положительные результаты у морских свинок даже при наличии в инъецируемом материале 5-6 микобактерии (Р.О. Драбкина (1963), Е.А. Финкель, Л.В. Михайлова (1976), А.Акопян, Е.Мумджиева (1977), С.И. Антипова (1977), В.В. Поспелов и соавт. (1982), М.Т Клименко с соавт. (1987), Пю Meissner (1970), Albrecht J., Reinfurht H. (1971), H. Hussels, K. Petersen (1973), K. Schroder., M. Topfer (1974), U. Mller, Urbanczik (1976), K. Knig (1976) и др.

Однако, имеется и альтернативная точка зрения. Так, С.М. Вульф (1968) считает, что сравнительное изучение результатов бактериологического материала при заражении морских свинок и параллельном посеве на питательные среды, не всегда позволяет выявить существенные преимущества биологической пробы.

При постановке биологической пробы изучали различные методы заражения лабораторных животных: подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, интратестикулярный, внутрисердечный, внутримозговой, в оболочки глаза, внутрикожный.

В ветеринарной практика для постановки биологической пробы на туберкулез, в основном, пользуются подкожным методом введения патологического материала лабораторным животным. Этот же метод является основным при определении вирулентности возбудителя туберкулеза.

При работе с кроликами наиболее приемлемым считается внутривенный способ заражения. В основном этот метод используется при определении вида возбудителя туберкулеза. Возбудитель туберкулеза бычьего вида у кроликов в период от трех недель до 2-3 месяцев после заражения вызывает генерализованный процесс, который характеризуется увеличением легких с множеством туберкулезных очагов, часто с наличием некрозов. В печени и селезенке изменения чаще ограничиваются появлением отдельных небольших узелков. Очаговые изменения могут развиваться в почках.

Микобактерии туберкулеза человеческого вида у кроликов вызывают отдельные очажки в легких и редко в почках, чаще же поражения отсутствуют.

У кроликов при заражении микобактериями птичьего вида развивается заболевание в виде тяжелой септицемии без видимых туберкулезных изменений в органах, приводящей животное к гибели через 14-20 дней (туберкулез типа Йерсена), или же в виде милиарного туберкулеза, обусловливающего гибель животного через 30-40 дней (туберкулез типа Вильмена) (цит. по Гаспарян И.Г., 1950).

Как отмечает Я.А. Благодарный (1980), почти половина кроликов, зараженных подкожно культурой M. bovis, в дозе 0,1 мг, погибла в течение 40 дней. Культура микобактерий человеческого вида к гибели их не приводила в течение 4-8 месяцев (срок убоя).

Микобактерии туберкулеза человеческого и бычьего видов у морских свинок при подкожном заражении вызывают развитие генерализованного туберкулеза в сроки от 3 недель до 2-3 месяцев после заражения культурой. В месте введения культуры образуется незаживающая язва и наблюдается увеличение регионарного лимфатического узла.

Микобактерии птичьего вида у морских свинок, как правило, вызывают только абсцесс в месте введения культуры и увеличение регионарного пахового лимфатического узла (А.П. Аликаева, 1950).

Е.М. Ксендзов и И. Х. Фабрикант (1940) считают, что экспериментальный туберкулез у морских свинок протекает всегда остро, в виде генерализованного процесса. У морских свинок туберкулезный процесс не знает стадии затихания или остановки и ведет к неминуемой смерти.

В медицинской фтизиатрии широко изучали интратестикулярный метод заражения. Он применяется для заражения самцов кроликов и морских свинок. Заражение в тестикулы легко выполнимо и наглядно, так как в семеннике рано заметна воспалительная реакция на введение микобактерий.

P. Gastinel et Nevot (1952) установили, что при интратестикулярном заражении морских свинок 0,04-0,1 мг M. Tuberculosis уже на 5 день развивается орхит.

О целесообразности интратестикулярного метода заражения морских свинок для изучения экспериментального туберкулеза сообщали С.Х. Лаанес, Э.И. Тюри (1958, 1961). Авторы считают, что при интратестикулярном методе заражения макроскопические туберкулезные изменения развиваются в яичках морских свинок на пятый день, тогда как во внутренних органах – лишь на 15-20 дни после заражения.

Э.И. Тюри, М.Э. Сильд (1964), Э.И. Тюри, М.Э. Тюри (1964) установили, что выделенные от больных людей культуры M. Tuberculosis при интратестикулярном заражении обусловили развитие генерализованного туберкулеза на 15-й день. При подкожном заражении все выделенные от больных людей культуры M. Tuberculosis были маловирулентные для морских свинок.

При более углубленном изучении Э.И. Тюри, М.Э. Тюри (1964, 1965) показали, что у морских свинок при интратестикулярном заражении M. Bovis туберкулезные изменения были более распространенными и развивались раньше и быстрее, чем при подкожном методе заражения.

В связи с тем, что лабораторные животные при обычных методах заражения туберкулезом маловосприимчивы к атипичным микобактериям, Э.И. Тюри, М.Э. Тюри (1964) рекомендуют использовать при определении патогенности различных микобактерий интратестикулярный метод заражения морских свинок. Однако, по данным О.В. Мартмы, Э.Ю. Тюри (1968), атипичные микобактерии при этом методе заражения в органах морских свинок вызывают туберкулезоподобные изменения.

В.Н. Василев (1971) предложил применять внутривенное заражение морских свинок. Однако, этот метод оказался малоприемлим, так как типичные патологоанатомические изменения не успевают развиться из-за того, что животное погибает через 4-5 дней от сепсиса.

А.С. Донченко с соавт. (1985) показали, что при внутривенном заражении M. Bovis морские свинки гибли с интервалом от 107 до 115 суток.

Для изучения вирулентности различных групп микобактерий применяли внутрикожный метод заражения лабораторных животных. М.Т. Дыхно с соавт. (1963) считают, что при этом методе заражения M. Tuberculosis гибель морских свинок наступает через полтора месяца.

А.Д. Панкратова (2003), Ю.И. Смолянинов, Н.С. Боганец, А.Д. Панкратова (2004) показали, что внутрибрюшинное введение ППД-туберкулина для млекопитающих морским свинкам в дозе 1 мл стандартного разведения (50000 МЕ) через 30 дней после заражения возбудителями туберкулеза бычьего и человеческого видов вызывает анафилактический туберкулиновый шок с последующей гибелью в течение 16-25 часов. Срок постановки диагноза на туберкулез при этом методе сокращается на 29 дней, или в 1,8 раза.

А.М. Харченко (1986) установил, что при внутрикожном введении микобактерий туберкулеза бычьего вида отмечалась интенсивная пролиферация клеток, преимущественно ретикулярного типа в легких, приводившая к утолщению межальвеолярных перегородок. В печени обнаружили очаги из эпителиоидных клеток, пролиферацию ретикулоэндотелиальных клеток, скопления гистиоцитов по капиллярам. В селезенке имелись пролифераты, состоящие из эпителиоидных клеток. В лимфатических узлах встречали очаги казеоза, окруженные соединительнотканной капсулой.

При внутрикожном введении морским свинкам микобактерий туберкулеза птичьего вида легких автор наблюдал утолщение межальвеолярных перегородок; в селезенке – размножение ретикулярных клеток; в печени – слабо выраженные изменения, в виде образования мелких очажков из гистиоцитов. Автор считает, что при внутрикожном заражении изменения у морских свинок выражены слабее, чем при подкожном.

Недостатком данного метода является использование для заражения чистой культуры микобактерий, а не патологического материала, использование которого для постановки биопробы, по нашему мнению, должно быть первым в диагностике туберкулеза.

Кроме перечисленных методов заражения для инфицирования лабораторных животных использовали внутрисердечное, алиментарное, конъюнктивальное, интротораксальное и интраназальное введение микобактерий. Все эти методы не получили широкого применения и используются для экспериментального воспроизведения туберкулезного процесса в отдельных органах.

Таким образом, в ветеринарной практике биологический метод исследования на туберкулез считается наиболее эффективным способом выделения микобактерий. Он позволяет обнаружить микобактерии при наличии единичных особей патологическом материале, тогда как при посеве для получения роста 1 колонии требуется, чтобы в 1 мл материала находилось 20-100 микобактерий туберкулеза.

2.7. Патоморфологический метод

При лабораторной диагностике туберкулеза у животных, наряду с бактериологическим, применяют и патоморфологический метод исследования - патологоанатомическое вскрытие и гистологическое исследование.

Сущность метода заключается в обнаружении у больных туберкулезом животных типичных морфологических изменений в лимфатических узлах и органах.

Признаками заболевания туберкулезом при гистологическом исследовании являются:

1) Некротизированный очаг, окруженный зоной эпителиоидных, гигантских и лимфоидных клеток и соединительнотканной капсулой;

2) Частичное или полное обызвествление;

3) Капсула соединительной ткани состоит из отдельных фибробластов и небольшого количества, нежных коллагенновых волокон (в отдельных случаях);

4) Гранулемы, образующиеся при актиномикозе, микозах и паразитарных болезнях. В этих случаях регионарные лимфатические узлы не поражены и причины, вызвавшие изменения, легко выявляются при гистологическом исследовании, при паратуберкулезе сходные изменения наблюдается в брыжеечных лимфатических узлах и кишечной стенке, но без образования некрозов.

Гистологическое исследование биоматериала от животных позволяет выявлять реакцию организма на воздействие микобактерий.

Наличие характерного строения узелков с эпителиоидными и гигантски клетками, обнаружение кислоустойчивых микобактерий в них являются показателями для морфологической диагностики туберкулеза (П.И. Кокуричев, Н.А. Налетов (1987).

Характерные особенности патогенеза и патологической морфологии туберкулеза определяются древностью этой инфекции, хроническим течением и волнообразным проявлением клинико-анатомических форм (В.П. Шишков, Н.А. Налетов, О.В. Якушева, 1991).

Болезнь получила название туберкулез по морфологическому признаку - образованию бугорков - туберкулов, формирование которых свидетельствует о хроническом течении процесса. Образование туберкулов происходит в результате воспаления, развивающегося в органе на месте оседания микобактерий туберкулеза. Сформированный туберкулезный узелок содержит в центре сухую крошащуюся некротизированную массу, часто с крупинками извести. Периферия узелка, ближе к центру, гранича с некрозом, состоит из пояса эпителиоидных, гигантских клеток, часть из них, прилегающая к казеозному центру при прогрессирующем туберкулезе, находится в состоянии дистрофии и некроза. За эпителиоидными клетками располагаются лимфоидные, а затем фибробласты, образующие соединительнотканную капсулу.

Наиболее часто изменения при туберкулезе у крупного рогатого скота находят в лимфатических узлах. В них обнаруживают уплотненные очаги, на разрезе которых видны творожистые некрозы желтоватого цвета, как правило, содержащие известь.

Н.А. Налетов (1959), В.П. Шишков, Н.А. Налетов (1980), В.П. Шишков и соавт. (1991) считают, что поражение лимфатических узлов проявляется в двух формах – бугорковой и диффузной. Доля бугорковой формы характерны как отдельные туберкулы разной величины, так и их конгломераты. Пораженный узел бугристый и увеличен в размере. При диффузной форме выявляют обширные участки поражения лимфатических узлов, с неровными, нечетко очерченными краями. Они из казеозной массы с глыбками извести, кое-где сохраняются участки живой ткани. Нередко встречаются смешанные формы, при которых наряду с сформировавщимися бугорками имеются очаги диффузного казеоза. Иногда диффузное поражение протекает в форме крупноклеточной гиперплазии, без казеозного распада.

По данным П. П. Вишневского (1935), В.Е. Щуревского и соавт. (1990), при легочной локализации, преимущественно на выпуклом крае легких, под самой плеврой, можно обнаружить несколько первичных очагов, представляющих собой различного размера сероватые полупрозрачные узелки, величиной от просяного или чечевичного зерна до размеров лесного ореха. На разрезе такие узелки сухие. Содержат казеозную массу с заметным обызвествлением ее.

В.Е. Щуревский с соавт. (1980) указывают, что изменения в легких чаще имеют узелковое строение. В связи с этим различают милиарный, мелко – и крупноузелковый туберкулез.

Н.З. Хазипов с соавт. (1985) указывают, что туберкулезный аффект легкого гистологически характеризуется экссудативной пневмонией с богатым фабризиозным выпотом в альвеолы. Вокруг основного фокуса наблюдается зона перифокального воспаления в виде серозного отека легочной ткани. Центральная часть воспалительного фокуса подвергается творожистому некрозу, а по периферии очага развивается грануляционная ткань.

Н.З. Хазипов с соавт. (1985) считают, что для поражения плевры при туберкулезе у крупного рогатого скота чаще характерна жемчужница. Жемчужные разращения перикарда и эпикарда ничем не отличаются от таковых на плевре. При поражении внутривенного листка перикарда и эпикарда могут образовываться сращения между ними.

Поражения слизистых оболочек гортани, трахеи, сычуга, кишечника, матки может быть в виде узелков, распадающихся в последующем в язвы, встречается также изъявление слизистых оболочек без предварительного образования узелков П.П. Вишневский, 1935; Фихтнер, 1939; Н.З. Хазипов и соавт., 1985; П.И. Кокурчиев, Н.А. Налетов, 1987).

При генерализованной форме туберкулеза патологический процесс может охватывать не только внутренние органы, но и матку, яичники, кишечник и даже костную ткань, кожу, подкожную клетчатку (М.К. Юсковец, 1953; П.И. Кокуричев, Н.А. Налетов, 1959; E. Gaver, 1968; P. Rittenbach, E. Kth, 1969; T. Schlisser, 1985; Н.З. Хазипов и соавт., 1985; В.Е. Щуревский с соавт. 1980, и др.).

Однако, мелкие гранулемы могут иметь паразитарное, грибковое и другое происхождение. Кроме того, мелкие абсцессы также напоминают гранулемы (В.Е. Щуревский с соавт., 1980). Особенно часто обнаруживают у животных гранулемы, заполненные казеозной массой, легко вылущивающиеся из окружающей ткани (А.Т. Дрогун с соавт., 1987). Дифференциация патологоанатомических изменений возможна при гистологическом и бактериологическом исследованиях.

Известно, что гистологическое исследование дает возможность выявить типичные для туберкулеза изменения. Несмотря на многообразие проявления туберкулезного процесса, во всех случаях обнаруживают очаг некроза, вокруг которого расположена зона эпителиоидных и отдельных гигантских клеток, окруженных лимфоидными клетками и соединительной капсулой. В казеозной массе можно обнаружить возбудителя туберкулеза в окрашенных по Циль-Нильсену срезах.

Обнаруженные типичные для туберкулеза гистологические изменения дают основание для постановки предварительного диагноза на туберкулез. Окончательный диагноз ставят по результатам бактериологического исследования с применением биопробы-для установления вида возбудителя туберкулеза (В.Е. Щуревский и соавт., 1990; Н.П. Овдиенко и соавт., 1991; А.С. Донченко с соавт., 2003).

А.И. Струков, И.П. Соловьева (1986) отмечали, что гранулематозные воспаления, характерные для туберкулеза человека, выявляли при более чем 60 болезнях. Смешанную инфекцию паратуберкулеза и туберкулеза крупного рогатого скота описали E. Momatani и T. Yoshino (1984). При этом они отмечали, что гранулемы при этих инфекциях можно дифференцировать гистологическим методом.

П.Е. Савченко (1974) показал, что атипичные микобактерии при длительном пассировании могут вызывать туберкулозоподобные поражения.

В последние годы для сокращения срока постановки диагноза на туберкулез были разработаны ускоренные способы проведения биологической пробы на морских свинках (Ю.И. Смолянинов с соавт., 2004; А.С. Донченко с соавт., 2004; Н.С. Боганец, 2006), белых мышах (А.А. Белобородова, 2008), перепелах и карликовых кроликах (П.В.Бушмелёва, 2011).

Приведенные литературные данные свидетельствуют о том, что постановка диагноза на туберкулез или другие микобактериальные инфекции у животных может быть решена только при проведении и оценки результатов комплексных исследований - бактериологического и патоморфологического.

2.8. Молекулярно-генетические исследования

В последние годы в ветеринарной лабораторной практике для диагностики многих инфекционных болезней животных используют молекулярные методы. Среди разнообразия молекулярных методов наибольшее распространение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР) различных модификаций.

Полимеразнаяцепнаяреакция(ПЦР)заключаетсяв копировании выбранного фрагмента генома возбудителя во много миллионов раз с помощью термостабильной ДНК-полимеразы в термоциклере, обеспечивающем необходимое дляпроцесса циклическое изменение температуры по заданной программе. ПЦР была разработана К. Мюллисом (фирма "Cetus", США) в 1983 году, за что в 1995 году автор был удостоен Нобелевской премии. Метод ПЦР основан на уникальной способности ДНК к самовоспроизведению - репликации,включающей расплетение двойной спирали ДНК, расхождение ее нитей и достраивание на них дочерних цепей

ДНК по принципу комплементарности.

ЗапоследниегодыразработанрядмодификацийПЦР: с обратной транскрипцией, с «горячим стартом», с внутренним контролем, гнездовая (Nested PCR), с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, изотемпературная (хеликазо-зависимая, проводится при одной температуре и не требует амплификатора), (А.Д. Забережный, 2010; Zmiriam Vincent, Yan Xu, Huimin Kong, 2004; Т. Notomi, Н. Okayama, Н.Masubichi, Т.Yonekawa, K. Watanabe et al., 2000). В настоящее время известна ещё одна модификация ПЦР, называемая «Linear-after-the-exponential», что означает синтез однонитевой ДНК после окончания ПЦР в той же пробирке, с последующей ДНК-ДНК гибридизацией с флуоресцентными зондами и одновременным выявлении нескольких мишеней по различным спектрам флуоресценции (Р. Kenneth, W.Lawrence, 2007).

Внедрение ПЦР в лабораторную диагностику туберкулёза крупного рогатого скота привело к необходимости повышения достоверности и исключению получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов исследования.

Высокая чувствительность реакции обуславливает проблему возможной контаминации, т.к. попадание в реакционную пробирку даже следовых количеств ДНК (специфических продуктов амплификации ДНК, положительного контрольного образца, ДНК возбудителя) приводит к получению ложноположительных результатов ПЦР. При детекции продуктов ПЦР методом горизонтального электрофореза в агарозном геле такие контаминации являются весьма вероятными. Кроме того, на этапе пробоподготовки и выделения ДНК возможен другой вид контаминации перекрёстной, от пробы к пробе, что также приводит к получению ложноположительных результатов. Следует учитывать, что обычные режимы автоклавирования лабораторной посуды и инструментария не обеспечивают полного разрушения ДНК. Определить и ликвидировать источник контаминации достаточно сложно (Е.Е. Ларионова, 2005; О.А. Иртуганова, 2006).

Второй недостаток ПЦР - это ложноотрицательные результаты. Причинами получения ложноотрицательных результатов могут стать потери ДНК на этапе её выделения, ингибирование активных компонентов реакционной ПЦР-смеси, а также неправильный отбор патологического материала, нарушение правил его хранения и транспортировки. По данным зарубежных авторов ингибирование клинических проб наблюдается в 10,8- 54,5%, в зависимости от способа выделения ДНК (К.К. Abu-Amero, 2004).

Важным этапом при постановке полимеразной цепной реакции является подготовка исследуемой пробы материала для ПЦР - анализа (А.Н. Шаров, 2003; Е.П. Осипова, 2004; Е.Е. Ларионова, 2005; Е. Valentine-Thon).

Дальнейшие разработки в области молекулярной диагностики направлены на автоматизацию ПЦР-исследований.

В доступной литературе, достаточно данных о применение ПЦР метода в лабораторной диагностике туберкулёза крупного рогатого скота. Однако эти данные довольно противоречивы. Повидимому, поэтому, в настоящее время метод ПЦР применяют в лабораторной практике ветеринарии, как дополнительный метод при исследовании подматериала от убитых животных и идентификация культур микобактерий.

И. Г. Мальков с соавт. (1993) предложили применять метод ПЦР в качестве альтернативного биохимическим методам исследований при идентификации культур микобактерий туберкулёза человеческого и бычьего видов.

И.Л. Обухов с соавт. (2004) отмечали, что разработка нового метода диагностики туберкулёза с применением ПЦР даёт наиболее полную и точную картину распространения этой болезни в природных очагах. Однако применение ПЦР в лабораторной практике осложняется получением большого количества ложноотрицательных и ложноположительных результатов.

А.Н. Шаров (1998, 2000, 2002, 2003) указывает на возможность применения метода ПЦР для прижизненной диагностики туберкулёза у животных путём проведения многократных регулярных исследований объединённых проб носовой слизи животных и предлагает использовать полимеразную цепную реакцию в качестве дополнительного метода при послеубойной диагностике туберкулёза.

И.П. Суханов (1999)установил большую эффективность биологического метода диагностики при исследовании послеубойного материала и предложил использовать ПЦР для контроля благополучия молодняка крупного рогатого скота по туберкулёзу и выявления заражённых животных путём регулярных исследований носовой слизи.

Б.И. Антонов (2002) указывает на точечное применение метода ПЦР при диагностике туберкулёза крупного рогатого скота, в зависимости от каждой конкретной ситуации и считает, что метод ПЦР не может заменить существующие методы классических исследований.

И.В. Ефимычев (2002) считает, что в задачу ПЦР не входит установление диагноза. ПЦР позволяет выявить небольшой участок генома, который является маркёром данного возбудителя. Наличие ДНК возбудителя в организме животного не всегда свидетельствует о заболевании. Для установления диагноза необходимо проводить весь комплекс лабораторных исследований.

Е.П. Осипова (2004) установила, что при исследовании методом ПЦР экспериментально заражённых животных, возбудитель туберкулёза может находиться в организме заражённых "животных, но не обнаруживаться в крови. В то же время, исходная культура возбудителя в 83,3% случаев выделяется с мочой заражённых животных. При исследовании методом ПЦР верхнего слоя питательной среды, засеянной суспензией патматериала от заражённых туберкулёзом телят, ДНК M. Bovis выявляется в 100% случаев, при отсутствии видимого роста колоний микобактерий.

А.Х. Найманов, Н.П. Овдиенко, Е.П. Осипова и др. (2004, 2005) отмечают, что диагностика туберкулёза крупного рогатого скота должна быть комплексной. ПЦР целесообразно использовать в лабораторной диагностике туберкулёза крупного рогатого скота как дополнительный экспресс-метод при исследовании патматерила от убитых с диагностической целью животных и дифференциации культур М. bovis и M. tuberculosis от других видов микобактерий.

Т.А. Борисова (2004) установила, что ДНК вакцинного штамма М. bovis BCG обнаруживается в молоке и крови у 100% иммунизированных животных в течение 3-х месяцев, у 30% животных - через 4 и 5 месяцев. При сравнении метода ПЦР с культуральным и патологоанатомическим методами установлено преимущество метода ПЦР.

М.С. Калмыкова (2007) изучала диагностическую ценность ПЦР тест-систем четырёх производителей и установила: что все тест-системы обладают разной диагностической чувствительностью и специфичностью.

Автор предлагает в неблагополучных по туберкулёзу хозяйствах, в целях контроля качества проведённой текущей и заключительной дезинфекции помещений ферм и прифермских территорий, объекты внешней среды исследовать методом ПЦР на наличие ДНК возбудителей туберкулёза.

Т.В. Гребенникова с соавт. (2006), Корнева И.Н. с соавт. (2002, 2004), М.В. Альварес Фигероа с соавт. (2006) подобрали специфические праймеры и разработали тест-системы для индикации возбудителей туберкулёза в патматериалеи дифференциальной диагностики культур микобактерий.

Н.А. Донченко (2008) усовершенствовал методику постановки ПЦР для дифференциации микобактерий на основе геномного полиморфизма.

Н.И. Хаммадов (2009) установил преимущество фенольно-хлороформной экстракции нуклеиновых кислот, изучил и подобрал наиболее эффективные праймеры для проведения межштаммовой и межвидовой дифференциации микобактерий, создал систему интерпретации результатов молекулярного генотипирования микобактерий.

Т.А. Янченко (2011) разработала метод ускоренного выявления микобактерий туберкулёза на основе комбинированного применения культурального метода и полимеразной цепной реакции, который сокращает сроки исследования и повышает достоверность диагностики на 33,4%.

В последние годы разработано и внедрено в медицинскую и ветеринарную лабораторную практику большое количество тест-систем, не только позволяющих провести индикацию и идентификацию возбудителей туберкулеза, но и определить лекарственную устойчивость штаммов к противотуберкулёзным препаратам (М.В. Альварес Фигероа с соавт., 2007, 2010; М.А. Владимирский с соавт., 2007; М.А. Гордукова с соавт., 2010; Е.А. Долгова с соавт., 2010).

Представленный обзор литературы показывает, что ПЦР метод до настоявшего времени не нашел достойного применения при диагностике туберкулёза животных. Тем не менее, ПЦР постоянно совершенствуется, приобретает новые качества и возможности для использования в широкой ветеринарной практике.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в лаборатории микобактериозов Ветеринарного института ТАСХН Республики Таджикистан в 2009-2013 гг. в соответствии с планом НИР “Эпизоотический мониторинг и разработка систем комплексных мероприятий по оздоровлению животных и птиц от туберкулеза в разных регионах Республики Таджикистан”. Изучение эпизоотической ситуации по туберкулезу проводили по данным ветеринарной отчетности службы государственного ветеринарного надзора Республики Таджикистан с учетом собственных аллергических и бактериологических исследований крупного рогатого скота, результатов бактериологических исследований районных ветеринарных лабораторий и СББЖ районов Хатлонской области (2009-2013 гг). За период работ нами проведено аллергическое исследование крупного рогатого скота на туберкулез в частном и общественном секторах в количестве 16030 голов крупного рогатого скота. Исследовано более 215 проб (крови, почвы, воды, фекалий, молока, мокроты и носовой слизи.

В работе использовали ППД туберкулин для млекопитающих, производства ФГУП «Курская биофабрика – фирма БИОК», физиологический раствор, инсулиновые шприцы, кутиметр, цифровой ветеринарный кутиметр НПФ «КОСТА», безыгольные инъекторы БИ-7. Для выращивания микобактерий туберкулеза использовали глицериновые МПА, МПБ, картофель, плотные, яичные питательные среды Левенштейна-Йенсена, Гельберга и Петраньяни, Финн-2. Аллергические исследования проводили в соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» от 18.11.2002 года.

Исследования крупного рогатого скота проводили внутрикожной туберкулиновой пробой. Шприцы и иглы стерилизовали кипячением в дистиллированной или кипяченой воде. Места инъекции выстригали, протирали 70% спиртом – ректификатом. При учете аллергических реакций проводили измерения утолщения кожной складки. Учет реакций проводили через 72 часа после введения туберкулина. Реагирующими считали животных с утолщением кожной складки на 3 мм и выше. Для диагностического убоя отбирали животных реагирующих на введение туберкулинов. Аллергические исследования и убой реагирующих животных проводили комиссионно, с участием представителей областных ветеринарных отделов и ветеринарных врачей хозяйств. На все проведенные аллергические и убой животных составляли акты с приложением описи реагирующих животных и актов убоя.

От животных, у которых при патологическом осмотре не обнаружили характерные для туберкулеза изменения, брали кусочки органов и лимфоузлов, у сомнительных также брали пробы крови, фекалии, носовую слизь, мокроту для лабораторного (бактериологического и биологического) исследования.

При проведении бактериологических исследований использовали бактериологический, культуральный и биологический методы.

Для исследования брали кусочки печени, селезенки, легких и лимфоузлы от убитых или павших животных. При наличии туберкулезных изменений в органах брали пробы из пораженных участков. При пересылке взятый материал консервировали в 30%-ном растворе глицерина.

При бактериоскопическом исследовании биоматериала от животных готовили мазки из лимфатических узлов и внутренних органов, высушивали и красили их по Циль-Нельсену.

При культуральном исследовании биоматериал от животных обрабатывали по методу А.П. Аликаевой (1963) и засевали на среды Левенштейна-Йенсена и ФАСТ-3Л.

Через 2-3 дня пробки пробирок парафинировали, посевы культивировали при температуре 37оС в течение 3 месяцев. При появлении роста определяли характер колоний, готовили мазки и красили их по Циль-Нельсену.

Скорость роста и культуральные свойства субкультур микобактерий изучали на среде Левенштейна-Йенсена при 25оС, 37оС, 45оС и 52оС, а также на мясопептонном агаре (МПА) и мясо-пептоном бульоне (МПБ) при 37оС.

Для определения вида микобактерий использовали биологический метод.

С этой целью ставили биопробу на трех морских свинках, трех кроликах и на трех курах. Культуру микобактерий вводили животным в дозе 1 мг сырой бактериальной массы, суспендированной в 1 мл стерильного физиологического раствора.

Морским свинкам – подкожно в области паха, кроликам – внутривенно в краевую вену уха, курам – в подкрыльцевую вену. У морских свинок при развитии туберкулезного процесса через 2-4 недели на месте введения культуры образовалась язва, а также увеличение и уплотнение регионарного лимфатического узла. Свинки прогрессивно худели.

У кроликов и кур при развитии туберкулеза наблюдали истощение и снижение аппетита. Кур исследовали туберкулином. Через три месяца морских свинок, кур и кроликов убивали, вскрывали и проводили бактериологичекое исследование паренхиматозных органов.

Принадлежность исследуемой культуры к тому или иному виду определяли по следующим данным:

- при генерализованном процессе у морских свинок и кроликов – M. Bovis;

- при генерализованном процессе у морских свинок и кроликов -отсутствие поражения или единичные очажки в легких – M. Tuberculosis;

- при генерализованном процессе у кур, а у кроликов сепсис – M. Avium

Бактериологическую и биохимическую идентификацию микобактерий проводили в несколько этапов:

Первый этап - родовая идентификация: самым важным родовым свойством МБ является строгая кислоустойчивость. Это свойство микроорганизмов определяли при окраске по Циль-Нельсену или флуорохромами. Для этого все культуры, выросшие на питательной среде подвергали окрашиванию и микроскопированию. Микобактерии при окрашивании карболовым фуксином устойчивы к обесцвечиванию солянокислым спиртом или неорганическими кислотами и имеют красный цвет.

Родственные микроорганизмы при окрашивании отличаются по форме, проявляют слабую кислоустойчивость и наряду с красными палочками могут отмечаться синие.

Второй этап – заключается в разделении микобактерий относящихся к M. Tuberculosis Complex (M. Bovis, M. Tuberculosis и т.д.) и на атипичные нетуберкулезные микобактерии (НТМБ).

Для дальнейшего изучения культуральных свойств микобактерий накапливали бактериальную массу выросших колоний на яичной среде. Для пересева отбирали колонии, наиболее характерные по внешнему виду для микобактерий туберкулеза.

Для дифференциации культур возбудителей туберкулеза бычьего, человеческого и атипичных микобактерий, накопленную бакмассу пересевали на различные питательные среды яичные, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА) и яичную среду с салицилатом натрия. Культивировали их при разных температурных режимах: 20-22о, 37-38о и 45оС.

Для пересева платиновой петлей (диаметр 2-3 мм) снимали 1-2 петли культуры и переносили в стерильную пробирку или пенициллиновый флакон. Бактериальную массу тщательно растирали в 1-1,5 мл физиологического раствора, который добавляли небольшими порциями в пробирку (флакон).

Приготовленную взвесь вносили пастеровской пипеткой по 2-3 капли в девять пробирок со средой Левеншей-на-Иенсена (по 3 пробирки на каждый температурный режим), в три пробирки яичной среды с салицилатом натрия, в три пробирки с МПА и МПБ. На пробирках делали надписи с указанием номера экспертизы, даты пересева и температурного режима культивирования. Пробки парафинировали и пробирки устанавливали в термостат при заданных температурах. Пробирки с посевами на мясопептонный бульон, мясопептонный агар и на яичную среду с салицилатом натрия инкубировали в термостате при 37оС.

При пересевах учет появления роста в первые 10 суток культивирования проводили каждые двое-трое суток и каждые пять дней в последующие три недели.

Характер роста на яичных средах МПБ описывали в следующем порядке:

пленка – наличие, отсутствие;

интенсивность развития пленки – тонкая, умеренно развитая, толстая;

поверхность пленки – гладкая, зернистая, морщинистая;

цвет пленки;

нити (наличие и характер): тонкие, толстые, короткие, длинные;

осадок – плотный, рыхлый, хлопьевидный, цвет.

изменение среды культирования – помутнение, цвет.

Помутнение среды указывало на загрязнение культуры.

- на МПА:

Микобактерии туберкулеза не образуют пигмент и растут на яичных средах без салицилата натрия, M. Tuberculosis и M. Bovis растут при температуре 38-37о, не растут на МПБ и МПА.

Появление роста в первые 7 дней и приобретение пигмента указывает на то, что выделенная культура не относится к M. Tuberculosis сomplex.

Для этой группы микобактерий характерно появление роста через 20-60 сутки, колонии имеют светло-кремовый цвет, шероховатую поверхность (R - форма), неровные края.

Видовая дифференциация микобактерий

Вид микобактерий Скорость

роста из материала, сут. Скорость

роста в субкультуре Пигментообразование Рост на яичных

средах при

температуре, оС Рост на МПБ Рост на

среде с сал.

натрия Колонии

20-22 37-38 45 M. Bovis 30-60 20-30 нет - + - - - сухие

M.Tuberculosis 30-60 20-30 нет - + - - - сухие

Фотохромогенные

(1 группа) 15-30 10-20 желтый пигмент на свету ± + - ± + сухие

Скотохромогенные

(2 группа) 15-30 10-25 желтый на свету и в темн. + + - ± + гладкие

влажные

Нефтохромогенные (3 группа) 15-20 10-25 нет ± + ± ± + гладкие

влажные

Быстрорастущие

(4 группа) 3-10 3-5 могут образов. пигмент ± + ± + + гладкие

влажные

Дифференциация по видам внутри M. Tuberculosis complex проводили используя биологическую пробу (на морских свинках, кроликах и курах).

Опираясь на способности образовывать пигмент и разной скорости роста проводили первичную идентификацию НТМБ:

Для пересева культур бактериальную массу снимали платиновой петлей в объеме 1-2 петель, переносили в стерильную центрфужную пробирку, тщательно растирали стеклянной палочкой и суспендировали физиологическим раствором, доводили концентрацию микобактерий до 10 мг/см3 до бактериальному стандарту вакцины БЦЖ. Из приготовленной бактериальной взвеси по 3-4 капли вносили пастеровской пипеткой в 7 пробирок со средой Левенштейна-Йенсена, из них по одной пробирке ставили в термостат при тепловых режимах 25оС, 37оС, 45оС и 52оС. Две пробирки использовали для изучения пигментообразования. Для определения толерантности культур к 5% NaСl её заливали в пробирку со средой с добавлением к ней хлористого натрия.

Одновременно засевали по одной пробирке культуры на мясопептонный бульон (МПБ) для дифференциации быстрорастущих культур от медленно растущих нетуберкулезных микобактерий и выращивали в термостате при температуре 37оС.

Для изучения пигментообразования две пробирки с микобактериями засеянными на среду Левенштейна-Йенсена, ставили в термостат при 37оС, причем одну из них (контрольную) плотно заворачивали в светонепроницаемую бумагу. Другую пробирку, не обернутую бумагой, на 7-е и 12-е сутки после посева микобактерий подвергали освещению электрической лампочкой мощностью 100 ват в течение двух часов на расстоянии 50-80см от источника света.

Учет пигментообразования проводили через 3 недели после посева культур. Культуры, образующие желтый пигмент на свету при отсутствие его в контрольных пробирках (метод Кеплера, 1986) относили к I группе по Раньону (фотохромогенные).

Если культура образовала пигмент на свету и при полном отсутствие света ее относили ко II группе (скотохромогенные), если пигмент не образуют ни в темноте ни на свету - к III группе по Раньону (нефотохромогенные).

Для окончательной идентификации видов НТМБ применяли

Дополнительные тесты.

Дополнительные тесты включают определение арилсульфатазной и амидазной активности, каталазы, гидролиз твина 80, восстановление нитратов и теллурита калия, рост на среде с хлористым натрием.

Каталаза – внутриклеточный фермент, участвующий в расщеплении перекиси водорода на воду и кислород. Наличие его определяется путем добавления перекиси водорода к суспензии исследуемой культуры микобактерий. При положительной реакции идет выделение пузырьков кислорода. По степени выделения пузырьков микобактерии делили на 2 группы: с низкой каталазной активностью (высота-более 45 мм). Низкая каталазная активность характерна для микобактерий туберкулезного комплекса, M. Marinum, MAC (комплекс avium- intracellulare), M. Xenopi, M. Malmoens.

При полуколичественном методе определения каталазы по Kubica:

1. Брали свежеприготовленный раствор перекиси водорода: 0,2 мл пергидроля на 10 мл дистиллированной воды;

2. Приготовленную среду Левенштейна-Йенсена разливали по 5 мл в пробирки. При свертывании среды пробирки должны находиться в строго вертикальном положении (без скоса);

3. На горизонтальную поверхность среды засевали 0,2 мл бактериальной суспензии, инкубировали в течение 2-3 нед при 35-37оС;

4. В пробирку с выросшей культурой добавляли 1 мл раствора перекиси водорода и измеряли высоту колонки пузырьков в миллиметрах после 5-минутного вертикального положения пробирки при комнатной температуре. По высоте колонки пузырьков – более или менее 45 мм – определяли степень каталазной активности.

Метод определения термостабильной каталазы (68оС), по Kubica

Некоторые виды МБ теряют каталазную активность при нагревании культуры до 68оС. К ним относятся МВТ, M. Bovis, M. Gastri. Термостабильную каталазу продуцируют M. Kansasii, M. Gordonae, M. Scrofulaceum, M. Fortuitum и многие другие виды МБ.

При определении термостабильной каталазы:

1. Брали свежеприготовленный раствор перекиси водорода: 0,2 мл пергидроля на 10 мл дистиллированной воды;

2. Для приготовления 100 мл фосфатного буфера рН 7,0 брали:

61,1 мл 0,0067М раствора двузамещеного фосфорнокислового натрия (9,47 г Na2 HPO4 на 1 л дистиллированной воды);

38,9 мл 0,067М раствора однозамещенного фосфорнокислого калия (9,07 г KH2PO4 на 1 л дистиллированной воды).

Арилсульфатаза – фермент, гидролизующий связь между сульфатной группой и ароматическим кольцом трикалий фенолфталеин дисульфата, входящего в состав среды с образованием свободного фенолфталеина. Наличие свободного фенолфталеина определяется по красному цвету среды, который появляется после добавления щелочи.

Арилсульфатазной активностью обладают быстрорастущие микобактерии. Учет реакции проводили на третий день инкубации. В течение этого периода положительная реакция наблюдалась у M. Fortuitum и M. Chelonae.

14- дневная арилсульфатазная активность наблюдается у M. Marinum, M. Xenopi, M. Trivial, M. Smegmatis и M. Flavescens.

Для определения арилсульфатазной активности

1. Готовили среду для выращивания МБ: к 100 мл расплавленного питательного агара добавляли 1 мл глицерина и 65 мг трикалий фенолфталеин дисфульта. Агар разливали в пробирки по 2-3 мл, автоклавируовали при 0,5 атм в течение 15 мин и давали застыть в вертикальном положении пробирки.

2. Готовили индикатор – 1 М раствор углекислого натрия (5,3 г Na2 CO3 на 100 мл дистиллированной воды). Приготовленный раствор хранили в холодильнике.

3. Суспензию культуры засевали по 0,2 мл на поверхность агара, инкубировали при 37оС в течение 3-14 дней. После окончания инкубации к выросшей культуре добавляли индикатор. Положительный тест – появления малиновой окраски, которая свидетельствовал о наличии свободного фенолфталеина.

Метод гидролиза Твин 80 по Wayne

Липазы, которые продуцируют некоторые виды МБ, гидролизуют Твин 80 до олеиновой кислоты и полиоксиэтиленсорбитола. Нейтральный красный в среде с рН 7,0 связан с Твин 80 и имеет янтарный цвет. При гидролизе Твин 80 нейтральный красный освобождается и приобретает свой обычный цвет. Этот метод используется для разделения потенциально-патогенных и сапрфитных МБ. Так, M. Gordonae и M. Malmoense гидролизуют Твин 80, а МАС и M. Scrofulaceum не гидролизуют его.

Техника выполнения

1. Для приготовления 100 мл М/15 фосфатного буфера рН 7,0 брали

а) М/15 раствор однозамещенного фосфорнокислого калия (9,07 г KH2PO4 на 1 л дистиллированной воды).

б) М/15 раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия (11,876 г KH2PO4 на 1 л дистиллированной воды).

Для получения 100 мл фосфатного буфера рН 7,0 берут 38,9 мл раствора «а» и 61,1 мл раствора «б».

2. Брали 0,5 мл Твин 80

3. Готовили 2 мл 0,1% водного раствора нейтрального красного.

4. Смешивали 100 мл фосфатного буфера, 0,5 мл Твин 80, 2 мл раствора нейтрального красного, разливали по 4 мл в пробирки и автоклавируовали 15 мин при 0,5 атм., хранили в холодильнике.

5. Эмульгируовали 1 лопаточку исследуемой культуры в пробирке с приготовленным реактивом. Инкубировали при 37оС. Реакцию читали через 5-10 сут. Реакцию считали положительной, если соломенно-желтый цвет изменяется на красный.

СХЕМА ИДЕНТИФИКАЦИИ КУЛЬТУР АТИПИЧНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ КИСЛОУСТОЙЧИВЫЕ МИКОБАКТЕРИИ

Морфологическая характеристика

колоний и клеток Дополнительные тесты

78041419685000Рост на 7-14 день Рост на 2-5 день

IY группа по Раньону

37782493492500646429336550063881033654008032752539900

Пигментные колонии Безпигментные

175894139700001813560139700004670425-3810009137651384290017589513842900913764-381000913765-444500

только на свету на свету и в темноте III по Раньону

248475417780005175241524000

I группа по Раньону II группа по Раньону 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ретроспективный анализ эпизоотической ситуации и зональные особенности проявления эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота в Республике Таджикистан

В связи с поставленными основными задачами по изучению видового состава микобактерий выделенных от реагировавших и нереагировавших на туберкулин животных и объектов внешней среды на территории республики Таджикистан, на первом этапе собственных исследований мы провели ретроспективный анализ эпизоотической ситуации и зональные особенности проявления эпизоотического процесса туберкулеза.

Зональные особенности проявлений эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота, зависящие от природно-климатических, социально-экономических, хозяйственных факторов и формы ведения животноводства отмечали многие исследователи (Н.А. Александров, 1973; Г.В. Чепик, 1973; А.О. Бокун, 1976; Д.Д. Новак с соавт., 1979; Б.Г. Мотаев, 1979; С.И. Джупина, 1985; Д.Д. Новак, С.А. Таубаев, 1985; Н.А. Шкиль, 1986, 1995; Н.А. Шкиль с соавт., 1997; Б.Я. Хайкин; В.А. Зубакин, 1989; Н.Ярбаев, 1993; Д.М. Мирзоев, 1997; Р.А. Нуратинов, 2000; З.А. Казиахмедов, 2004 и др.

Кроме того, В.Н. Кисленко, 1976; К.А. Шкиль с соавт., 1999; А.С. Донченко, В.Н. Донченко 1994, отмечают более широкое распространение туберкулеза на территориях с преобладанием солонцовых почв, в которых наиболее высокая выявляемость M. Bovis.

В эволюции оздоровительных и профилактических мероприятий по борьбе с туберкулезом в Таджикистане можно выделить несколько периодов. Первый период организационный (1931-1961 г.г.). Он связан со становлением экономики народного хозяйства молодой республики в составе СССР и организации ветеринарной науки на базе республиканской ветеринарной лаборатории, организованной в 1931 году. В этот период только регистрировали единичные случаи туберкулеза, так как в молодой республике были более актуальны острозаразные заболевания, причиняющие животноводству значительный ущерб. Только в 1961 году впервые были выявлены 3 неблагополучных пункта и 6 реагирующих на туберкулин животных.

Второй период – 1962-1970 гг. С 1962 года начинается выяснение истинной эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота. Так в 1962 г. выявили 19 неблагополучных пунктов. С 1968 года в научно-исследовательском институте ветеринарии Таджикистана расширены исследования по туберкулезу крупного рогатого скота. Организована специальная лаборатория по изучению туберкулеза сельскохозяйственных животных. В марте 1967 года Минсельхоз Республики утвердил план мероприятий по ликвидации туберкулеза среди с.х. животных и птиц на 1967 -1970 годы. Однако эпизоотическая ситуация с туберкулезом в республике оставалось сложной.

Третий период – (1971-1991 гг. характеризуется новыми условиями, связанными с переводом скотоводства на промышленную основу. В этот период были построены крупные комплексы по производству говядины, молока и специализированные хозяйства (фермы) по выращиванию телок и нетелей. Изменения условий содержания, кормления и использования животных отразилось на всех звеньях эпизоотической цепи и потребовали совершенствования комплекса профилактических мероприятий.

С 1983 года установлено увеличение количества больных туберкулезом животных и количества неблагополучных пунктов. Так в 1962 году было зарегистрировано 11 неблагополучных пунктов, а в 1983г. – 23 неблагополучных по туберкулезу пункта, т.е. количество неблагополучных пунктов увеличилось более чем в 2 раза.

Наиболее сильное распространение туберкулез крупного рогатого скота получил в 1987 году. При комиссионном обследовании хозяйств выявили 16410 реагирующих на туберкулин животных (3,7 %). Вновь выявили 86 неблагополучных по туберкулезу пунктов.

В 1988 г. количество реагирующих на туберкулин животных уменьшилось (10855 голов). Но количество неблагополучных пунктов на начало года составило 82, и вновь выявили 3 новых неблагополучных по туберкулезу пункта.

В 1989 году заболеваемость скота туберкулезом снизилась до 1,1% из общего числа первично исследованных животных. При убое 6355 животных туберкулез установили у 317 (5,0%). Выявили 1 новый неблагополучный пункта.

С 1992 г. начался четвертый период, характеризирующийся переходом к развитию агропромышленного производства на основе разнообразных форм частной собственности. В связи с распадом Советского Союза прекратилась централизованная поставка биопрепаратов, в том числе и поставка туберкулина.

В анализированный период времени по степени распространения туберкулеза крупного рогатого скота все районы республики можно распределить на 4 категории.

1. Районы благополучные по туберкулезу – районы Горно-Бадахшанской автономной области;

2. Районы с единичными неблагополучными пунктами – Пянджикентский, Исфаринский, Зарафшанский и Матчинский Ленинабадской области.

3. Районы, в которых регистрируется от 8 до 10 неблагополучных пунктов – районы Курган-Тюбинской зоны и районы республиканского подчинения.

4. Районы со значительным распространением туберкулеза - районы Кулябской зоны.

Проведенными исследованиями установлено, что в горной зоне туберкулез крупного рогатого скота практически не регистрируется или регистрируется только в единичных случаях.

Указанные факты подтверждают данные других авторов, что в горных зонах благоприятными факторами противодействующими распространению туберкулеза относятся: более эффективная естественная санация пастбищ и фермерских территорий; чистота воздуха и воды, небольшая плотность размещения сельскохозяйственных животных, преобладание мелких ферм, богатая растительность, ограниченные межхозяйственные связи, собственное воспроизводство стада, достаточное количество осадков и т.д.

Ретроспективный анализ выявления и оздоровления неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота пунктов за (1981-2012гг.) представлен в таблице 1.

Таблица 1.

Сведения о неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота пунктах в РТ за 1981-2012гг.

Годы Наличие небл. пунктов на 1.01 Выявлено новых в течение года Оздоровлено неблаг-х пунктов за год

1981 13 4 6

1982 11 13 14

1983 23 13 14

1984 22 9 8

1985 23 10 20

1986 13 86 3

1987 96 20 34

1988 82 3 39

1989 46 1 30

1990 17 2 7

1991 12 - -

1992 12 - -

1993 12 2 -

1994 14 1 2

1995 13 - -

1996 11 2

1997 9 1 3

1998 7 1 3

1999 5 - 3

2000 2 - 2001 2 2 -

2002 4 - 1

2003 3 - 1

2004 2 - 2005 2 1 2006 3 1 -

2007 4 - 1

2008 3 - 1

2009 2 - 1

2010 1 1 -

2011 2 - -

2012 2 - -

Ретроспективный анализ эпизоотической ситуации по туберкулезу в республике за 1981-2012 гг. показывает, что за этот период времени были спады и подъемы эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота.

Наибольшее количество неблагополучных пунктов было зарегистрировано в 1987 году – 96 н.п. В дальнейшем с 1987 года пошло постепенное снижение эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота в республике. Так, по состоянию на 01.01.2012 г. в республике оставалось только 2 неблагополучных пункта в Согдийской области.

Динамика выявления реагирующих на туберкулин животных в республике за 1994-2011 гг. представлена в таблице 2

Таблица 2.

Сведения о выделенных реагирующих на туберкулин животных

за 1994-2011гг.

Годы Исследовано

Выявлено реагирующих % выявле

ния

Всего Общест-

венный сектор Индиви-

дуальный

сектор

Всего Общест-

венный сектор Индиви-

дуальный

сектор

1994 6126 5724 402 156 138 18 2,5

1995 7615 4355 3260 177 172 5 2,3

1996 5907 3579 2328 24 21 3 04

1997 3686 2497 1219 53 47 6 1,4

1998 164618 4089 160529 62 62 - 0,04

1999 486848 273052 213197 86 84 2 0,02

2000 308559 192076 116483 5 5 - 0,002

2001 252635 164518 88117 - - - -

2002 216777 154568 62209 2003 191338 119307 72031 250 250 0,13

2004 215611 116306 99305 69 69 0,03

2005 247027 130000 106607 251 251 - 0,10

2006 231219 125126 106093 134 131 3 0,06

2007 265576 137091 128485 40 34 6 0,02

2008 254644 109783 144861 36 36 - 0,10

2009 227700 101405 126295 53 49 4 0,02

2010 208241 77678 130563 86 86 - 0,04

2011 222907 65988 156919 35 35 -0,01

Данные таблицы показывают, что в хозяйствах Республики в 1994-1995 гг. при первичном исследовании на туберкулез выявлено 2,3 -2,5% реагирующих животных. Распространению туберкулеза в этот период способствовала передержка больных туберкулезом животных без надлежавшей изоляции, как в общественных, так и в индивидуальных хозяйствах.

Так в 1994 году в хозяйствах республики было исследовано: в общественных хозяйствах -5724 головы, выявлено 138 голов реагирующих на туберкулин животных, что составило 2,4%; в частном секторе из 402 голов выявлено – 18 голов, что составило 4,48%.Следует отметить, что в этот период в хозяйствах республики не проводился весь комплекс противотуберкулезных мероприятий, направленный на обнаружение и уничтожение источника возбудителей инфекции, а также допускались погрешности в проведении диагностических исследований.

В дальнейшем причинами уменьшения распространения туберкулеза в хозяйствах области явилась организация мелких хозяйств общественного и частного сектора, и конечно, организация и проведение противотуберкулезных мероприятий.

Так, в 1994-1999 гг. в колхозах и совхозах, а также в хозяйствах индивидуального сектора были выявлены реагирующие на туберкулин 524 головы крупного рогатого скота в общественном секторе, что составило -0,27% от общего количества исследованных животных и 35 голов - в частном секторе соответственно 0,01%.

При исследовании животных в 2000-2005 гг. выявили 575 реагирующих животных в общественном секторе, что составило 0,07%, а в частном секторе реагирующих животных на туберкулин не выявлено.

В 2006 по 2011гг. при исследовании на туберкулез животных было выявлено в общественном секторе в 371 реагирующие животные, что составило 0,06% а в частном секторе выявлено 13реагирующих животных, что составило 0,002%, то есть количество реагирующих на туберкулин животных в частном секторе стало в 30 раз меньше чем в общественном секторе. Причинами резкого уменьшения количество реагирующих на туберкулин животных в частном секторе стало появление разных форм собственности, переход животных из общественного сектора в частную собственность, появление мелких подсобных хозяйств, в которых не проводились исследования молодняка на туберкулез.

Дальнейшее проведение противотуберкулезных оздоровительных мероприятий показывает уменьшение количества реагирующих на туберкулин животных в общественных хозяйствах и отсутствие реагирующих животных в частных хозяйствах.

Так, в 2011 году из 222907 голов животных, исследованных на туберкулез животных, выявлено только 35 реагирующих животных, что составляет 0,01%.

4.1. Актуальность проблемы выделения различных видов микобактерий на территории республики Таджикистан и климато-географическая характеристика Хатлонской области.

При проведении профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота проблема выделения различных видов микобактерий и изучение региональных особенностей ареала выделения этих микобактерий имеет теоретическое и практическое значение, так как составляет основу для дифференцированного проведения профилактических и оздоровительных мероприятий.

Установление видовой принадлежности выделенных культур микобактерий позволяет выявить ареал их распространения и источники инфицирования различных видов животных разными видами микобактерий.

Из литературных данных известно, во всех странах, где ведут целенаправленную борьбу с туберкулезом крупного рогатого скота, сокращается количество заболевших животных и неблагополучных пунктов. Однако, увеличивается количество реагирующего на туберкулин животных с неспецифическими реакциями, а от убитых с диагностической целью животных, как правило, выделяют нетуберкулезные (атипичные) микобактерии.

Таким образом, инфицирование поголовья крупного рогатого скота нетуберкулезными микобактериями – повсеместное и широко распространенное явление во всех странах мира.

В официальной отчетности Республики Таджикистан, учет результатов выделения и видового состава нетуберкулезных микобактерий не проводится.

Таким образом, частота выделения различных видов микобактерий и тем более сенсибилизирующие свойства этих микобактерий остаются неизученными.

Изучение этих актуальных, на современном этапе борьбы с туберкулезом людей и животных, вопросов мы провели в Хатлонской области.

4.1.1. Климато-географическая характеристика Хатлонской области РТ.

Хатлонская область расположена в южной части республики Таджикистан. На севере область граничит с районами республиканского подчинения, на востоке с Горно-Бадахшанской автономной областью, а на Юго-Востоке проходит граница с Афганистаном.

Хатлонская область была образована в сентябре 1988 г. в результате объединения бывших областей: Кулябская, Курган-тюбинская, а также города Нурек. В состав Хатлонской области входят 6 городов: Курган-Тюбе, Куляб, Нурек, Дангара, Сарбанд, Пяндж и 21 районов: Бальджуванский, Бохтарский, Вахшский, Восейский, Дангаринский, Джами, Джиликулский, Кабадиянский, Кумсангирский, Муминабадский, Пянджский, Руми, Темурмалик, Фархарский, Хамадани, Носири Хусрав, Хавалингский, Хурасанский, Шахритусский, Шурабадский и Яванский.

Главные реки: Пяндж и Вахш, водохранилища: Муминабадское, Сельбурское и другие.Климат-континентальный. Природно-климатические условия области отличаются неоднородностью, что связано с различной формой рельефа, большим диапазоном высот и различной ориентацией горно-долинных систем. Климат характеризуется большими суточными колебаниями температур воздуха, интенсивной солнечной радиацией и малой облачностью. Выпадение большей части осадков приходится в зимний-весенний период, для летнего периода характерны длительные засухи.

По характеру хозяйственной деятельности территория области делится на четыре климатических пояса: жаркий пояс, теплый пояс, прохладный пояс и холодный пояс.

Исходя из природной зональности, урожайности почв и наличия кормовой базы, области животноводства распределены по видам животных.

Ведется разведение гиссарских, тонкорунных каракульских овец, молочное скотоводство, разводят крупный рогатый скот и коз.

4.1.2. Анализ эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в Хатлонской области РТ

Хатлонская область была неблагополучной по туберкулезу крупного рогатого скота с 1970 года, самое большое выделение больных животных было выявлено в 1987 году, когда при проведении комиссионных исследований процент зараженности поголовья достиг до 3,12%, а целом по республике при проведении исследований количество выделенных больных животных в 1994 году составило–2,5%.

Анализ эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота за последние годы представлен в таблице 3.

Таблица 3.

Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в Хатлонской области РТ за 2001-2011 гг.

Годы Исследовано

Выявлено больных %выявления

Всего Общест-

венный сектор Индиви-

дуальный

сектор

Всего Общест-

венный сектор Индиви-

дуальный

сектор

2001 55430 46213 9217 - - - 2002 34567 27825 6742 - - - 2003 34567 27825 6742 227 225 2 0,65

2004 65630 50327 15303 69 68 1 0,1

2005 44286 33069 11217 2006 45682 34465 11217 60 59 1 0,1

2007 84297 45076 39221 10 6 4 0,01

2008 68253 24793 35460 4 4 - 0,001

2009 77715 35561 42154 11 7 4 0,01

2010 61691 25265 36426 4 4 - 0,001

2011 88136 22845 65291 5 5 - 0,001

Представленные в таблице данные показывают, что в результате проведенных оздоровительных мероприятий количество выявления реагирующих на туберкулин животных уменьшилось. Так, процент зараженности туберкулезом крупного рогатого скота в 2003 г. составлял – 0,65%, а к 2011 г. снизился до 0,001%.

Следует указать, что после распада СССР, планомерные противотуберкулезные мероприятия в Хатлонской области РТ стали проводить только с 2006 года.

В 2006 г. в хозяйствах области было исследовано 45 682 голов крупного рогатого скота из них 34465 голов в общественном секторе и 11217 голов в индивидуальном секторе. При этом выявлено реагирующих в общественном секторе -60 (0,17%), в частном – 1 (0,001%). Животноводческие хозяйства области оздоровливали методом выявления и убоя больных туберкулезом животных и полной заменой поголовья здоровыми животными из благополучных хозяйств других областей. Эпизоотическое обследование неблагополучных по туберкулезу хозяйств в этот период показало, что одной из причин длительного неблагополучия хозяйств в области заключалось в том, что диагностические исследования животных проводились с неполным охватом поголовья, допускалась передержка больных животных на фермах и подсобных хозяйствах, телят кормили необеззараженным молоком, а для воспроизводства использовали молодняк, полученный от больных туберкулёзом животных. Кроме того, немаловажной причиной возникновения туберкулеза и длительного проведения оздоровительных мероприятий в хозяйствах области являлась не качественная санация животноводческих помещений. Так, при исследовании объектов внешней среды, установлена инфицированность территории ферм, скотных дворов, животноводческих помещений возбудителями туберкулёза.

При исследовании 155 проб из объектов внешней среды неблагополучных по туберкулезу ферм было выделено 20 культур кислото-спиртоустойчивых микобактерий из них 3 культуры M. Bovis, 17- нетуберкулёзные микобактерии (идентификации нетуберкулезных микобактерий по видам не проводились). Кроме того, следует указать, что тёплый климат и многие другие внешние и внутренние условия для возникновения и распространения туберкулеза. Всего за 19 лет (1994-2012 гг.) в области было выявлено 82 неблагополучных пункта, выявлено 1566 голов реагирующих на туберкулин животных.

Эпидемическая ситуация по туберкулёзу

в Хатлонской области РТ

Таблица 4.

Заболеваемость людей туберкулёзом в Хатлонской области

2006-2011гг.

Районы Выявлено больных туберкулёзом людей - годы

2006 2007 2008 20009 2010 2011

Восейский 254 180 199 279 341 349

Кулябский 172 359 538 268 291 349

Фархорский 69 57 84 105 113 115

Всего по области 1853 2119 2496 2351 2412 2502

Данные таблицы показывают, что по данным санитарно-эпидемиологической службы, в районах области отмечается высокая заболеваемость туберкулёзом людей за 2006-2011 гг. Так, в 2006 г. в районах области было выявлено 1853 больных туберкулезом людей, а в 2011 г. – 2502. При этом, часто устанавливали внелегочную форму туберкулеза у людей. Болезненность составляла - 613, смертность - 51,2 на 100 тыс. населения. Наибольшая инфицированность людей туберкулезом регистрировалась в Восейском и Кулябском районах. Причем инфицированность животноводов обслуживающих неблагополучные по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйства была в 2 раза больше, чем в благополучных по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйствах. Так, при проведении профилактических исследований 104 животноводов Восейского района, при бактериологическом исследовании 31 пробы мочи, от одного владельца частного сектора хозяйства «Л. Лангариева», была выделена культура M. Bovis.

4.1.3. Оптимизация системы идентификации наиболее часто выделяемых видов микобактерий с применением культурально-морфологических, биологических молекулярно-генетических и бактериологических методов

Бактериологическое исследование предусматривает выделение возбудителя болезни в чистой культуре и его идентификацию по комплексу различных свойств. При проведении бактериологических исследований обычно руководствуются наставлениями и методичискими указаниями по диагностике инфекционных заболеваний.



Pages:   || 2 |



Похожие работы:

«План мероприятий в рамках проведения Года экологии в муниципальных образовательных учреждениях городского округа Самара 2017г. № Наименование мероприятий Сроки проведения Ответственные Информационно-организационные мероприятия Информацио...»

«-610870-393065-542925-297180МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждениевысшего профессионального образования"СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ"УТВЕРЖДАЮ Директор ИФБиБТ /В. А. Сапожников "_" 2012 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ Дисциплина _ М3.ДВ2 –...»

«Муниципальное образовательное учреждение средняя общеобразовательная школа № 2 г. Пошехонье Ярославской области Рассмотренана заседании МО Протокол № от "_" _ 20 г. Утверждена приказом директора образовательного учреждения №_ от "_" _ 20 г. Биология 8 клас...»

«Пояснительная записка. Рабочая программа по биологии составлена на основе Федерального закона от 29.12.2012 года 3273 – ФЗ "Об образовании в Российской Федерации", Приказа Министерства образования и науки Российской Федерации от 17.12.2010года, №1897 "Об утверждении федерального государственно...»

«Муниципальное образовательное учреждение средняя общеобразовательная школа № 2 г. Пошехонье Ярославской области Рассмотренана заседании МО Протокол № от "_" _ 20 г. Утверждена приказом директора образовательного учреждения №_ от "_" _ 20 г. Биология...»

«АДМИНИСТРАЦИЯ НИЖНЕПЫШМИНСКОГО муниципального образования Тюменского района тюменской областиПОСТАНОВЛЕНИЕ 12 апреля 2017 г. № 24 Об организации сбора и определении места первичного сбора и размещения отработанных ртутьсодержащих ламп у потребителей ртут...»

«Задания заочного тура VII открытой олимпиады "Будущее Кавказа" среди учащихся образовательных учреждений городов субъектов СКФО. Работа по предмету Фамилия Имя Отчество _ Класс школа Республика _ Город Биология 11 класс 1. Вопрос. Гиппократом было создано учение о соках организма тип...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГАОУ ВО Новосибирский национальный исследовательский государственный университет Факультет естественных наук "УТВЕРЖДАЮ" Декан ФЕН НГУ, профессор _Резников В.А. "29" августа 2014 г. Рабочая программа дисциплины Биоинформ...»

«УДК [579.841.11+579.842.11]:616-002-092.9-053:612.017.1 Т. И. Коваленко, В. В. Минухин., Е. М. Климова*ИММУНОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ РАЗНОГО ВОЗРАСТА НА МОДЕЛИ ГЕНЕРАЛИЗОВАННОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО...»

«Тест срезовая проверочная работа по экологииИзначальным источником энергии в большинстве экосистем служат:А) минеральные веществаБ) солнечный светВ) пищевые объектыРельеф, климат, почва, воздух относятся к:А) биотическим факторамБ) абиотическим фактора...»

«МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ЭКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ГИДРОМЕТЕОРОЛОГИИ И МОНИТОРИНГУ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт гидрометеорологиче...»

«Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (Новосибирский государственный университет, НГУ) Утвержда...»

«Муниципальное бюджетное образовательное учреждение "Гимназия № 3" г. Белгорода Определение наличия витамина С в натуральных и консервированных фруктовых соках Автор: Старинская Алена, ученик 8 а класса Руководитель: Борисова А. В., учитель биологии 2012 г. г. Белгород Оглавление Введение.........»

«л-фараби атындаы аза лтты УНИВЕРСИТЕТі ылыми-дістемелік кеес мжілісінде бекітілді №6 хаттама "07" маусым 2017 ж. Оу ісі жніндегі проректор Хикметов А.К. 6М070100 Биотехнология мамандыы бойынша МАГИС...»

«Общие сведения о ГИА 2017 Государственная итоговая аттестация в 9 классе Основной Государственный Экзамен (ОГЭ) в 11 классе Единый Государственный Экзамен (ЕГЭ) для отдельных категорий граждан Государственный Вы...»

«Экологическая тропа как средство формирования экологических представлений у детей дошкольного возраста Пономарёва Юлия Анатольевна, студентка ГОУСПО Новокузнецкий педагогический колледж №2, Руководитель: Маринич Наталья Владимировна, преподаватель ГОУСПО Новокузнецкий педа...»

«Методические рекомендации по "Экологическим основам природопользования" Методические рекомендации разработаны с целью оказания методической помощи студентам для самостоятельной подготовки по экологическим основам...»

«Правительство Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский университет "Высшая школа экономики" Факультет мировой экономики и мировой политики Кафедра мировой экономикиВЫПУСКНАЯ КВА...»

«5.3. Проблемы рационального использования и охраны ресурсов биосферы В сохранении биологического разнообразия главенствующая роль принадлежит особо охраняемым природным территориям. Это участки земли и части водного пространства, в том числе природные комплексы, имеющие особое экологическое, научное, культур...»

«План работы МО учителей естественно-гуманитарного цикла ГУО "Средняя школа № 22 г. Могилева" на 2016/2017 учебный год Заседание 1 Тема: "Нормативное правовое и учебно-методическое обеспечение преподавания истории и обществоведения, химии, биологии, географии в 2016/2017 учебном году" Форма проведения: инструктивно-методиче...»

«УДК 622.5АНАЛИЗ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ В ДОНБАССЕ И ПУТИ ЕЁ УЛУЧШЕНИЯ Ряснянская А., Макеева Д.А. Донецкий национальный технический университет Проанализирована динамика экологических проблем Донбасса. Предложены ряд работ и меро...»

«ПРОТОКОЛ общественных слушаний в форме открытых собраний по проекту "НПС "663км". Прием откачка нефти с НПС им. Т.Касымова" Дата проведения:26.08.2016 года Время проведения: 15-00 час Место проведения: зал заседаний офис по ул. Смагулова,12. Информация о проведении общественных слушаний доведена до сведения общест...»

«МИКРОСКОП (порядок заказа) Здравствуйте!   Информируем, что до 16 мая 2017 г. идет прием заявок от образовательных организаций на закупку детских микроскопов. Микроскоп – это прибор, при помощи которого можно увеличить изображение изучаемых объектов: прозрачных биологических препаратов и твердых предметов, не пропускающ...»







 
2017 www.li.i-docx.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.